蛋白质的定义

蛋白质的定义：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子；种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；表达生物遗传性状的一类主要物质。

特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均含量为16%。

凯氏( Kjedahl )定氮法测定蛋白质含量：蛋白质含量=6.25×样品含氮量

单纯蛋白质（simple protein）: 也称简单蛋白质，完全由氨基酸组成的蛋白质。

(1) 清蛋白（albumin）：溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。如血清清蛋白。

(2) 球蛋白（globulin）：不溶于水而溶于稀盐溶液，如血清球蛋白

(3) 谷蛋白（glutelin）：不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、 稀碱，如米谷蛋白。

(4) 谷醇溶蛋白（prolamine）：不溶于水，但溶于70%～80%乙醇， 如玉米醇溶蛋白。

(5) 组蛋白（histone）：溶于水及稀酸溶液，分子中含Arg、Lys 较多，呈（弱）碱性，如小牛胸腺组蛋白。

(6) 鱼精蛋白（protamine）：溶于水及稀酸溶液，分子中含碱性氨基酸特别多，呈（强）碱性，如鲑精蛋白。

(7) 硬蛋白（scleroprotein）：不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液。 如胶原蛋白、角蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白等。

缀合蛋白质（conjugated protein）：也称结合蛋白质， 由蛋白质和非蛋白质两部分组成。

(1) 糖蛋白（glycoprotein）：含糖类，如胶原蛋白。

(2) 脂蛋白（lipoprotein）：含脂类，如血浆脂蛋白。

(3) 核蛋白（nucleoprotein）：含核酸，如核糖体。

(4) 磷蛋白（phosphoprotein）：含磷酸，如酪蛋白。

(5) 金属蛋白（metalloprotein）：含金属，如铁蛋白含Fe。

(6) 血红素蛋白（hemoprotein）：辅基为血红素，如血红蛋白。

(7) 黄素蛋白（flavoprotein）：辅基为黄素（FAD或FMN）， 如琥珀酸脱氢酶（含FAD）。

蛋白质重要生物学功能：作为生物催化剂---酶；代谢调节作用(多肽类激素)；；物质的转运和贮存；运动与支持作用；免疫保护作用；其他生物学功能：结构蛋白、毒蛋白

脂肪族氨基酸：

中性氨基酸—侧链基团在中性溶液中不发生解离，因而不带电Gly,Ala,Val,Leu,Ile

含羟基或硫氨基酸Ser, Thr , Cys, Met

酸性氨基酸及其酰胺—侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷Asp，Asn, Glu，Gln

碱性氨基酸—侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷Lys，Arg，His

Gly：无手性碳原子。Pro：为环状亚氨基酸。Cys：可形成二硫键。

蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鸟氨酸，是代谢途径中产生的。

等电点（isoelectric point,pI)：在某一PH环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带净电荷为零，在电场中不泳动。此时，氨基酸所处环境的PH值称为该种氨基酸的等电点（pI)。

带电状态判定：p I－pH＜0-带负电 p I－pH＞0-带正电 p I－pH＝0-不带电

等电点计算：侧链为非极性基团或虽为极性基团但不解离的氨基酸：pI＝ (pK1 + pK2 )/2；

酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 ；碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2

例2:LyspK1=2.18,pK2=8.59,pK3=10.53,问在pH为4.0和在11.5时各带何种电荷,并说明在电场中的移动方向；

解.因Lys属于碱性氨基酸,所以,它的等电点为:pI=(pK2+pK3)/2=(8.59+10.53)/2=9.56

当pH为4.0时,pI大于pH,故是在酸性条件下,氨基酸本身带正电,在电场中向阴极移动.

当pH为11.5时,pI小于pH,故是在碱性条件下,氨基酸本身带负电,在电场中向阳极移动.

氨基酸与茚三酮的反应（颜色反应）

与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应

首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构

鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸

该反应产生黄色物质

苯异硫氰酸酯（PITC）的反应

由Edman于1950年首先提出

为α- NH2的反应用于N末端分析，又称Edman降解法

氨基酸的光谱性质：组成蛋白质的氨基酸中，Trp、Tyr和 Phe对紫外光有一定的吸收，这是因为它们分子中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的，这三个氨基酸的光吸收都在280nm附近

氨基酸内容知识点：常见的20种氨基酸的分类；氨基酸的酸碱性，pI的计算方法；氨基酸的重要化学反应和光学性质

肽键(peptide bond):一个氨基酸分子的α-羧基与另一个氨基酸分子的α-氨基在适当的条件下经脱水缩合形成的酰胺键。

肽:由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。

组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。 肽链书写方式：N端→C端

酰胺（肽peptide unit）平面参与组成肽键的6个原子位于同一平面；它是蛋白质构象的基本结构单位。

寡肽（oligopeptide）:十个以内(或十几个）氨基酸 相连而成的肽。

氨基酸残基数目在50个以上，且具有特定空间结构的肽称蛋白质；

凡氨基酸残基数目在50个以下，且无特定空间结构者称多肽。

肽的酸碱性：主要决定于肽键中的游离末端的α－NH2、游离末端α－COOH及侧链R基上的可解离功能团；

长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链上的

原则： 当溶液pH大于解离侧链的值，占优势的离子形式是该侧链的共轭碱，当溶液pH小于解离侧链的值，占优势的离子形式是该侧链的共轭酸。

肽与氨基酸不同的反应有：双缩脲反应 ；肽键的紫外吸收 210～230nm

谷胱甘肽(glutathione,GSH)

蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序（sequence），一级结构的主要连接键是肽键。

共价结构:包括蛋白质的肽链数目、端基组成、氨基酸序列和二硫键的位置。

一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。

一级结构的测定主要用小片段重叠的原理，测序步骤：

一，多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。如：血红蛋白（四聚体）可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。

二，测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目

三，二硫键的断裂 ：用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键

四，测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比

五，分析多肽链的N-末端和C-末端

N端分析方法

1.二硝基氟苯（DNFB）法

2.丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。

3苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法 ）

4.氨肽酶（aminopeptidase, Apase）法

C端分析

1.硼氢化锂还原法

2.肼解法：也称联氨法；

肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离

3.羧肽酶（carboxypeptidase, Cpase）法

六，多肽链的部分断裂：采用特异性的酶或化学试剂将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来（至少做两套）。

化学方法：

1.溴化氰（CNBr）裂解法: 只断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键。

胰蛋白酶（trypsin）:常用，专一性强，只断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽键。

糜蛋白酶（chymotrypsin）：即胰凝乳蛋白酶。断裂Phe,Trp,Tyr等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键。

胃蛋白酶(pepsin)：断裂键两侧残基都是疏水性氨基酸。

金黄色葡萄球蛋白酶：又称Glu蛋白酶，在Glu和Asp残基的羧基侧断裂肽键。

梭状芽孢杆菌蛋白酶：或称Arg酶，专门裂解Arg残基的羧基所形成的肽键。

七，分离纯化单一肽段

八，测定每个肽段的氨基酸顺序 ：

1.Edman降解法

2.酶降解法:外肽酶

3.MS法

4.根据核苷酸序列的推定法

九，确定肽段在多肽链中的次序：找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列。

十，确定原多肽链中二硫键的位置 ：对角线电泳

蛋白质序列数据库

1.PIR（Protein Information Resource）数据库

2.EMBL数据库

蛋白质共价结构内容知识点：肽和肽键的结构；多肽的化学性质及等电点计算；蛋白质的序列测定（部分蛋白酶的酶切位点和和化学试剂的断裂位点；N，C端-氨基酸残基的测定、二硫键定位、根据实验结果推测蛋白质的序列）

蛋白质的一级结构：

研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。

定义：蛋白质中的氨基酸数目种类排列顺序等称为蛋白质的一级结构。

体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原。蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子。

同源蛋白(homologous protein ) ：是指在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。

不变残基（invariant residue )：同源蛋白中的氨基酸序列中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，把这些氨基酸称为不变残基。

可变残基（variable residue):其他位置的氨基酸残基对不同物种有相当大的变化，称可变残基。不同种属的可变残基有很大变化。可用于判断生物体间亲缘关系的远近.

*蛋白质的空间构象是其功能活性的基础，构象发生变化，其功能活性也随之改变。

在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的别构效应(allostery)。

许多蛋白质的功能与其他分子的可逆结合有关，与蛋白质发生可逆结合的分子叫配体（ligand)

肌红蛋白（myoglobin, Mb):存在于肌肉组织运输和贮存氧气；一条多肽链和一个辅基血红素构成，含153个氨基酸残基；肌红蛋白氧合曲线（双曲线）

辅基血红素（heme）；肌红蛋白－血红蛋白家族以二价铁(Ⅱ)作为氧合结合部位。肌红蛋白－血红蛋白家族中铁由有机分子原卟啉Ⅸ(protoporphyrinⅨ)固定。原卟啉Ⅸ与铁的络合物铁原卟啉Ⅸ称为血红素(heme)。铁原子可以是亚铁或高铁氧化态。只有亚铁态的蛋白质才能结合O2。

血红蛋白（hemoglobin，Hb):在血液中结合并转运氧；血红蛋白的亚基组成；（血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形）

脊椎动物的血红蛋白由4个多肽亚基组成，两个是一种亚基，两个是另一种亚基。每个亚基都有一个血红素基和一个氧结合部位。

O2与肌红蛋白的结合

血红素非共价地结合于肌红蛋白分子的疏水空穴中；铁在第5配位键与珠蛋白His93（近侧His）的咪唑N结合，氧合时，第6配位被O2占据His64（远侧His）与Fe原子距离远而不发生相互作用，但与O2能紧密接触。

血红蛋白的两种构象： T态和R态

无氧存在时，血红蛋白血红素Fe原子的第6个配位位置是空着的，生成去氧血红蛋白；

有氧存在时，能够与氧结合形成氧合血红蛋白；

血红蛋白存在两种主要构象态：T态（紧张态，tense state）和R态（松弛态，relaxed state）；

O2和两种构象的Hb都能结合，但对R态Hb的亲和力更高，并且氧的结合更稳定了R态。

当血红蛋白的一个α亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。

这种由于蛋白质分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象称为变构效应(allosteric effect)。

一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与其配体的结合能力的想象，称为亚基间的协同效应(cooperativity)。

如果是促进作用则称为正协同效应(positive cooperativity)

如果是抑制作用则称为负协同效应（negative cooperativity)

H+和CO2促进氧的释放（Bohr效应）

去氧血红蛋白对Ｈ+的亲和力比氧合血红蛋白大，增加［Ｈ+］（降低pH）将提高氧从血红蛋白中的释放。Ｈ+可看作血红蛋白氧合的拮抗物（antagonist）；

CO2水合将增加组织中的［Ｈ+］（pH下降）；这种pH对血红蛋白对氧的亲和力的影响被称为Bohr效应。

BPG降低Ｈb对氧的亲和力 ：

BPG（2,3-二磷酸甘油酸）是Hb的一个重要的别构效应物；

BPG带多个负电荷，能结合在脱氧Hb的中央腔，并降低Hb对氧的亲和力。 β链His143的正电荷有利于结合BPG。

血红蛋白病（hemoglobinopathy）：由于或α或β链发生了变化，如镰刀状贫血病(sickle-cell anemia)；

地中海贫血(thalassemia)：由于缺少了α或β链，如α-和β-地中海贫血。

“分子病” (molecular disease):由于基因结构改变，蛋白质一级结构中的关键氨基酸发生改变,从而导致蛋白质功能障碍,出现相应的临床症状。

小结：肌红蛋白的结构与功能及氧结合曲线；血红蛋白（hemoglobin,Hb)的结构与功能及氧结合曲线；镰刀形红细胞贫血的机理；

蛋白质的二级结构：蛋白质的二级结构是指多肽链骨架中原子的局部空间排列,不涉及侧链的构象。也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置。维持二级结构的力量为：氢键

蛋白质二级结构的主要形式：

1. α---螺旋（α----helix）: 结构要点:①多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧。②每圈螺旋含3.6个氨基酸，螺距为0.54nm。③每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。

永久性卷发是一项生物化学工程

2、-折叠(- pleated sheet):①多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。 ②两段以上的β -折叠结构平行排列 ，两链间可顺向平行，也可反向平行 。③两链间的肽键之间形成氢键，以稳固β -折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。

3、-转角(- -turn):① 肽链内形成180º回折。②含4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 –N-H 之间形成氢键。③ 第二个氨基酸残基常为Pro。

4、无规卷曲(coil):没有确定规律性的肽链结构。

影响二级结构形成的因素:

影响α-螺旋形成的因素:氨基酸侧链所带电荷 、大小及形状。

β -折叠形成条件: 要求氨基酸侧链较小

超二级结构: 在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。

超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域．

基本的组合形式：α α；ββ；βαβ.

和结构域 :蛋白质结构中的若干个二级结构和/或结构花样（motif）通常会依据特定的几何位置排列形成较为致密的称为“结构域(domain)”的球形结构。

1.结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。

2.结构域一般由100~200 个氨基酸残基组成，但大小范围可达 40~400 个残基。

3.结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上。

蛋白质的三级结构:蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠，从而生成特定的空间结构。包括主链和侧链的所有原子的空间排布。一般非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核，极性侧链在分子表面。

特征：长度缩短:球形、椭球形、杆状等；多数同时含有螺旋和折叠；

氨基酸位置由侧链极性决定：非极性（内）、极性（表面，少数在内部）、带电（表面）；

次级键维系：疏水键、盐键、氢键、范德华力、二硫键；

功能区：表面或特定部位。

蛋白质的四级结构：蛋白质的四级结构：是指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用。寡聚蛋白质中亚基的立体排布及相互作用。

亚基（subunit)：是指寡聚蛋白中的每个独立三级结构单元。

寡聚蛋白：是指许多蛋白质是由两个或两个以上独立的三级结构通过非共价键结合成的多聚体。亚基之间的结合力主要是氢键和离子键。

如，血红蛋白的四级结构得测定由佩鲁茨1958年完成，其结构要点为：

球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基；两条α链，两条β链，α2β2；α 链：141个残基； β链：146个残基；分子量65 000；含四个血红素辅基亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部。

蛋白质分子中的共价键：一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→亚基→四级结构

次级键:维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键

维系蛋白质分子的二级结构：氢键

维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键

维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键

键的特点：氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键;氢键、范德华力虽然键能小，但数量大;疏水相互作用力对维持三级结构特别重要;盐键数量小;二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定.

知识点:-螺旋、 -折叠和-转角的结构特征;蛋白质的一级结构、二级结构、超二级结构和结构域、三级和四级结构概念;维持蛋白质空间结构的主要作用力。

蛋白质的降解和氨基酸代谢

氮平衡的意义：可以反映体内蛋白质代谢的慨况。

必需氨基酸(essential amino acid)：指体内需要而又不能自身合成，必须由食物供给的氨基酸，共有8种： Ile异亮、Leu亮、Met甲硫、Val缬、Lys赖、Phe苯丙、Trp色、Thr苏。

其余12种氨基酸体内可以合成，称非必需氨基酸。

食物中的蛋白质要经过蛋白质降解酶的作用降解为多肽和氨基酸被人体吸收的过程叫做蛋白质降解

1. 溶酶体（lysosome）无选择的降解蛋白质

2. 泛素（ubiquitin）给选择降解的蛋白质加以标记 ；真核细胞中蛋白质的降解：需要ATP、泛素

E1:泛素活化酶（Ubiquitin-activating enzyme）

E2:泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzyme）

E3:泛素蛋白质连接酶（ubiquitin-protein ligase）

（一）氨基酸的脱氨基作用

1. 氧化脱氨基作用 （oxidative deamination) ：氨基酸在酶的作用下氧化脱氢，同时释放出氨基的过程

催化氨基酸氧化脱氨的酶: L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶和专一性氨基酸氧化酶。（这类酶是需氧酶，以FAD为辅酶）

L-谷氨酸脱氢酶（L-glutamate dehydrogenase）：分布：Liver，Kidney，Brain ；不需氧脱氢酶；辅酶：NAD+ or NADP+；别构抑制：GTP、ATP；别构激活：GDP、ADP。

谷氨酸脱氢酶是目前发现的广泛而唯一存在于生物体内专一性高活性的

氨基酸酸脱氢酶

2. 非氧化脱氨基作用：主要发生在微生物中。

3. 转氨作用（transamination）：在转氨酶的催化下， α-氨基酸的氨基转移到α-酮酸的酮基碳原子上，结果原来的α-氨基酸生成相应的α-酮酸，而原来的α-酮酸则形成了相应的α-氨基酸，这种作用称为转氨基作用或氨基移换作用。谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT)；谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT) 。

谷氨酸 Pyruvate 磷酸 醛

磷酸

丙酮酸

α-Ketoglutarate

(α-KG) Ala

α-酮戊二酸 丙氨酸

4. 联合脱氨基作用

转氨基作用与L-谷氨酸氧化脱氨基作用联合起来进行的脱氨方式。

a、转氨酶与L-谷氨酸脱氢酶作用相偶联。此种方式既是氨基酸脱氨基的主要方式，也是体内合成非必需氨基酸的主要方式。主要在肝、肾组织进行。通过转氨和氧化脱氨联合作用进行脱氨

b、转氨基作用与嘌呤核苷酸循环相偶联。此种方式主要在肌肉组织进行。

（二）脱羧基作用

氨中毒(ammonia poisoning)：大量氨入脑，与α-酮戊二酸合成谷氨酸，或与脑中的谷氨酸合成谷氨酰胺，造成脑中α-酮戊二酸减少，TAC减弱，ATP生成减少，引起大脑功能障碍的现象。严重时可导致肝昏迷。

氨的去路：1.重新被利用（重新合成氨基酸或者合成氨甲酰磷酸）2.排泄出体外

氨的同化与贮存

（1） 重新合成氨基酸

（2） 合成氨甲酰磷酸

生理意义：谷氨酰胺是氨的解毒产物，也是氨的储存及运输形式

氨的转运：丙氨酸-葡萄糖循环(alanine-glucose cycle)

生理意义：① 肌肉中氨以无毒的丙氨酸形式运输到肝。② 肝为肌肉提供葡萄糖。

1932年德国学者克雷布斯（Krebs）等首先提出尿素生成的鸟氨酸循环学说。

鸟氨酸循：

蛋白质的性质与纯化:

蛋白质稳定的因素：1、水化膜:2、颗粒表面电荷:

变性作用（denaturation）

概念：在某些物理或化学因素作用下, 使蛋白质分子原有的特定的空间结构被破坏，从而导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失的现象。

物理因素: 加热、紫外线、X-射线、超声波等。

化学因素: 酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂（尿素、盐酸胍）、重金属盐等。

变性后的表现：

▼ 生物学活性消失▼ 理化性质改变

蛋白质的沉淀作用

使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。

方法： ▼盐析▼有机溶剂沉淀法▼重金属盐沉淀▼生物碱试剂与某些酸类沉淀▼加热变性沉淀法

蛋白质的颜色反应主要与其定性、定量测定有关： ▼双缩脲反应

双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物

通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产物的颜色深浅在540nm处进行蛋白质的定量测定。

酚试剂（Folin-酚试剂）反应

蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将Folin-酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常用来定量测定蛋白质含量。可根据反应产物的颜色深浅在540nm处进行蛋白质的定量测定.

茚三酮反应：

由于蛋白质多肽链两端有游离的a-NH2和a-COOH，所以蛋白质也可以和茚三酮发生反应。

考马斯亮兰(Coomassie brilliant blue G-250 )

与蛋白质反应形成蓝色透明物质，在595nm下进行比色。

蛋白质的紫外吸收特征

大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。最大吸收波长=280nm

目标蛋白质的分离纯化程序

（1）前处理（Pretreatment）---细胞破碎，蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。

（2）粗分级（Rough fractionation） 当蛋白质混合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。

（3）细分级（Fine fractionation） 是将样品进一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去。

（4）结晶（Crystal）由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。

因此，在目标蛋白质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质特定的折叠结构受到破坏。

蛋白质的分离及纯化

蛋白质可以通过各种生物化学技术纯化

利用蛋白质的大小、溶解度、净电荷以及与配体结合特异性上的微小差异。

透析和超过滤；凝胶过滤;离子交换层析;亲和层析;电泳（垂直板电泳、等电聚焦电泳、双向电泳）等分离纯化方法。

根据分子大小不同的纯化方法

透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开

超过滤（ultrafiltration) 利用压力或离心力使蛋白质溶液通过有一定截流分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。

密度梯度离心

● 凝胶过滤

● 也称分子排阻层析、分子筛层析（Size-exclusion Chromatography） 。

● 常用的凝胶 :

● 葡聚糖凝胶（商品名Sephadex）

● 聚丙烯酰胺凝胶(商品名Bio-GelP)

● 琼脂糖凝胶(商品名因生产厂家而 不同)

根据溶解度差别的纯化方法

等电点沉淀

盐溶（salting in) 和盐析(salting out)

盐溶是指蛋白质溶液中由于加入低浓度的中性盐后，使蛋白质溶解度增加的现象称为盐溶。

盐析是指高浓度中性盐可使蛋白质分子脱去水化层并中和其电荷而使蛋白质从溶液中凝集出来的现象叫做盐析。