非蛋白氮的概述和检测方法

发布时间：2002-11-08

1非蛋白氮的概述

非蛋白氮大致可以分为以下几类， ①尿素及其衍生物类， 如缩二脲、羟甲基尿素等;

②氨态氮类，如液氨、氨水等；③铵类，如硫酸铵、氯化铵等；④肽类及其衍生物，

包括氨基酸、酰胺、胺等；⑤动物粪便及其它废弃物类。以下是几种常见的非蛋白氮

的介绍：

1.1双缩脲

又称缩二脲，是一种尿素缩合产品，其含氮量在 35 %上，蛋白质当量为 219 %。

缩二脲难溶于水，一般的定量检验方法为紫红色配位化合物比色法（原理：鱼粉中的

双缩脲经抽提后，在酒石酸钠的碱性溶液中与硫酸铜生成紫红色配位化合物，在

550nm 波长下比色从而测出其含量）。

1 . 2尿素

是氮和二氧化碳在高温高压下化合而成。纯尿素的含氮量为 47 %，折合蛋白当量

为293 . 75 %。易潮解，易溶于水，一般的定量检验方法有二种：一种为二甲基氨基 苯甲醛显色法；另一种为二嗪衍生物显色法。但以上两种方法只能测定游离性尿素而 不能测定其衍生物。

1. 3尿素甲醛聚合物

是由尿素和甲醛聚合而成，其含氮量为 38.89 %，折合蛋白当量为 243 . 06 %。

该聚合物难溶于水。

1．4 硫酸铵

俗称肥田粉，其含氮量为 20 ％左右，折合蛋白当量为 125 ％。硫酸铵的工业品一 般为白色或微带黄色的结晶，易溶于水，其分子式为（ NH4 ） 2SO4 。

1 ． 5 异亚丁基二脲

又名二脲异丁烷，简称 IBDU ，为尿素和异丁醛在催化剂的作用下综合反应生成。

IBDU 为一种子的白色粉末或颗粒， 总含氮量为 32 ．18 ％，折合蛋白当量为 201.13 ％， 吸湿度远低于尿素。

以上是比较常见的非蛋白氮物质。 随着科技的发展， 还会有越来越多的非蛋白氮物 质被合成出来，从而使反刍动物所用的非蛋白氮使用广泛，而掺假者很容易将此物质 掺入饲料原料中以提高原料的粗蛋白质。

2非蛋白氮的检验

2．l 非蛋白氮的定性检验

在对原料样品的检测中，一般有定性检测和定量检测。在定性检测中，使用的比较

多的为显微镜检，包括直接镜检、分层镜检（用四氯化碳或三氯甲烷分层）、反应剂

镜检（用化学物质和样品中的某些物质反应而在显微下区分）、染色镜检等。在使用 的过程中，往往使用一项或多项镜检方法对样品中的物质进行判定。

对于非蛋白氮的检验，显微镜检是一种比较有效的方法。在对样品的检测中，一般

使用的是生物显微镜，其放大的倍数在 36〜400倍之间，为了获得更好的显微效果，

可以根据实际情况作出具体的调整。以下是镜检使用过程中的一些技巧：

2.1.l 直接镜检

直接镜检一般所用的倍数比较小，通过对样品不同的物理特征，如颜色、透明度、 表面组织、形状等物理性状进行判定。特别的要与典型的样品进行比较，以便能够更 好区分样品与杂质的不同。在直接镜检中，用不同的滤光片有时可以起到比较明显的 效果。虽然直接镜检比较方便和直观，但有时对于样品中的物质很难区分时，可以用 其它的检验方法。

2.1.2 分层镜检

将样品用四氯化碳进行脱脂和比重分离之后，样品与其它物质的区分会更加容易。 对样品中的有机物和无机物分层之后，需在常温下干燥后再进行镜检。非蛋白氮一类 的物质与原料的很多外观性质很不一样，通过两者的特异性之间的观察，可以对样品 中是否掺有非蛋白氮一类的物质作出一个大概的判断。

2 ．1．3 反应剂镜检

用反应剂和样品进行反应， 非蛋白氮一类的物质的化学性质和样品不一样， 通过此 种方法可以对样品中的非蛋白氮进行鉴别。经过四氯化碳分层之后，再与反应剂反应 是比较好的一种方法。而镜检时在样品中加一滴或数滴浓硫酸，观察样品与浓硫酸反 应的情况是一种比较直观的鉴别方法。因为无论动物蛋白还是植物蛋白，其与浓硫酸 的反应速度和产生的现象比较明显。

2.1.4 染色镜检

用染色剂对样品进行染色， 使样品中的植物或动物细胞染成不同的颜色， 而非蛋白 氮一类的物质则和样品的染色后的表现不同，通过此种方法使两者区分开来从而加以 鉴别。以下是比较常用的染色方法：

对植物细胞的染色方法： 番红——固绿染色法。 取适量脱胎 （视样品脂肪多少而定， 可以用四氯化碳，也可以用丙酮，对于脂肪少的也可以不用脱脂）样品于烧杯中，用

1 %的番红水溶液浸泡I〜3h水洗（去多余的染料）。将样品涂在玻片上，稍晾干。

滴加0 . I %的固绿（溶剂用 95 %乙醇）。过15s后滴加95 %的乙醇，冲去多余固 绿染料。待乙醇稍挥发后，加甘油液（甘油 ：水=1:1 ）浸润，加盖玻片。用生物显微 镜检查。染色结果：细胞核，木质化细胞壁呈鲜红色，纤维素细胞壁、细胞质呈绿色。

因为非蛋白氮没有细胞核、细胞质等结构，所以只要能够较好的掌握染色技巧，其对 比效果比较明显。当然，不能从染色效果判断其一定为非蛋白氮。

对动物细胞的染色方法：苏木精——曙红对染法。取适量的脱脂样品于烧杯中，加 入埃利希苏木精染色液浸泡 3 〜5min ，水洗数次（用 5min 左右）。将样品涂在玻片 上，滴加氨水。 3〜4s 后立即满加水，洗 I min ，稍晾一下，加 0.2 %曙红水溶液浸 润 3min ，滴加 95 %的乙醇，洗去多余曙红染料。再稍晾一下，加甘油浸润，加盖玻 片，用生物显微镜观察。其染色的结果为：细胞核呈蓝色，细胞质呈淡红色。通过此 种方法染色，一般能够很容易的区分样品和非蛋白氮一类的物质。

为了能够更清晰的在显微镜下区分样品与杂质， 也可采用以下方法 （对于检验鱼粉 一类的物质比较有效）：先用四氯化碳或三氯甲烷对样品分层，除去无机物，必要时 再用丙酮进行脱脂，再取一定量的样品置入蒸馏水中，搅拌，除去溶于水的物质，再 用60目或80目的样品筛过滤，将样品放入 50〜60 C的烘箱中进行烘干（时间不能 过长，以保持样品原来的状态） ，然后在显微镜下进行检验或再对其进行处理后镜检。

在显微镜检中，只能对非蛋白氮作初步判断。若要进一步的分析判断，还需进行定 量分析检验。

2.2非蛋白氮的定量检验

在非蛋白氮定量的检测方法中，比较常用的方法是硫酸铜沉淀法和氨基酸测定法。 除此之外，本文根据非蛋白氮的组成结构的不同，采用水解蒸馏法对样品中的非蛋白 氮进行检验。

2.2.l 硫酸铜沉淀法

根据非蛋白氮的化学性质来看，大部分溶于水，一部分在常温下不溶水，但在沸水 中溶解。根据此种性质，可以先将样品煮沸，用硫酸铜将样品中的蛋白质沉淀下来， 由于非蛋白氮已经溶于水，故可用过滤方法将其与样品中的蛋白质分离。在过滤时， 水的温度一定不能太低，否则象双缩脲一类的物质会因为不溶于常温水而不能被过滤 掉。用此种方法测定出的蛋白质含量称为样品的真蛋白质。但实际上，此种方法 有 很大的局限性。如果非蛋白氮不溶于沸水，或者将一般的非蛋白氮微囊化，此种方法 测出的结果会与样品中的实际真蛋白有很大的差异。

2.2.2氨基酸测定法

为了真正能够判定样品中是否掺有非蛋白氮，需测定样品中的氨基酸含量。无论 采用经典的氨基酸自动分析仪分析 （柱后衍生） ，还是采用比较快捷的 HPLC 分析（往 前衍生），将所测定的氨基酸总量相加得到一个总氨基酸数值， 然后将此数值乘以 6.25 为 M ，和用凯氏定氮法测定的粗蛋白质 N 相比较， M 至少为 N 的 85 ％（ M 可能略大 于 N ）。如果低于此数值，则可以判定该样品中掺有非蛋白氮。

2.2.3水解蒸馏法

原理非蛋白氮主要包括以下五类：尿素及其衍生物类、氨态氮类、铵类、肽类及 其衍生物、动物粪便及其它废弃物类。如果在原料中掺有氨态氮类、铵类和粪便比较 容易判断（可采用硫酸铜沉淀法加镜检），一般很少将肽类及其衍生物掺入其中，剩 下比较难鉴别的就是尿素及其衍生物。尿素和尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐 或氨和其它的物质，在强碱的条件下可以蒸馏出氨气，原料中的蛋白质经过水解成氨 基酸盐，氨基酸盐在强碱条件下稳定，从而可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离。仪器 和设备：酒精喷灯，试管和其它常用的仪器。试剂与溶液： 6mol ／ 1 的盐酸溶液和其 它常用的试剂。测定方法：本文只列出用酸水解的方法。

采集有代表性样品约 100g ，混匀后用四分法缩分出 209 左右，将其粉碎，使其全部 通过 60 目样品筛。精确称取 0.300 0g 的样品，置于容积为 60ml 的试管底部（注 意样品勿沾在管壁上），加入30ml 6mol /1的盐酸溶液，将试管在距试管口 I〜2cm 处用喷灯加热并封口。将封好的试管置于干燥箱内，于 110 C下水解24h。冷却后打

开试管，将水解液过滤至 100ml 容量瓶中，用蒸馏水反复多次冲洗试管和滤纸，然 后定容至刻度。用 10ml 移液管移取 10ml 样液移入半微量式定氮仪的反应室中，加 入 2Oml 1:1 的氢氧化钠溶液蒸馏 10 min ，余下的步骤按照测定粗蛋白的方法进行 操作，得出样品所消耗的盐酸的体积为 V1 （ml ）。同时作空白滴定可得消耗的盐酸 的体积为 V0 ，设所称样品的质量为 M（g）。

非蛋白氮的粗蛋白质计算公式

CP（%） =（ V1-VO ）X CX o. 14 X 6.25/ M

3讨论及注意事项

3．1 关于尿素衍生物是否水解和水解是否完全的问题。从理论上讲，在强酸或强碱

和一定的温度（ 110 C）的条件下，尿素及其尿素聚合物一定会水解，但不一定能够

在 24h 内水解完全。经过笔者做了大量的试验，证明了缩二脲在 24h 内的水解程度

可达到 50 ％ 以上，尿素在同样的条件下的水解比率可达到 90 ％以上。即使水解不 完全，如果样品中含有尿素衍生物，其的数值 V1 也会远远的大于 V0 ，通过此数值， 也可判定样品中是否掺有非蛋白氮。

3.2 关于水解后的产物问题，经过笔者反复试验，确定该水解的最终物质为氨盐或一 水合氨。

3 ．3 关于用半微量蒸馏时所用碱量和所用的时间：通过笔者大量的实践，如果水解 程度比较完全，则按照做粗蛋白的方法确定蒸馏的时间，但笔者推荐将加碱量增大一 倍即 20ml ，蒸馏时间增大一倍以上即 10min 以上怎样做能使数据尽量的准确。

3 ．4 关于盐酸和氢氧化钠反应生成的大量的氯化钠对反应是否有影响的问题。笔者 做了以下试验：先用加热的方法除去水解完毕后的盐酸，使其大部分挥发，然后再加 等体积的氢氧化钠进行蒸馏，得出的结果可以看出：使用加热除去盐酸的方法和不除 去盐酸的方法得出的结果相差不大（已经考虑在加热过程中的氨的损失）。

3 ． 5 关于用碱水解的问题。碱水解的原理和酸水解不同，其方法是：在水解完毕以 后，加热让尿素放出氨气以除去非蛋白氮，然后再用盐酸中和，再用移液管移取一定 体积的样液，加入浓硫酸进行消化，其余的步骤按照测定粗蛋白质的方法进行（如用 碱水解，则不能用玻璃仪器，而要用聚四氟乙烯管）。

3 ．6 由于尿素的衍生物比较多，再加上笔者所能收集到的尿素衍生物有限，此种方 法不免会有一定的局限性，但作为另一种角度比较简单的鉴别非蛋白氮的方法，在实 际判定原料样品的过程中，具有一定的指导作用。