目录

摘要 1

Abstract 2

第一章 绪论 3

1.1研究背景 3

1.2国内外研究现状及研究意义 3

1.3 研究内容 5

第二章 Shewanella puterfaciens CN32及测试指标标线 5

2.1 CN32菌准备 5

2.1.1 收菌方法 5

2.1.2测收菌后OD值 6

2.1.3接菌 6

2.2铁标线 6

2.3菌体生长标准曲线 7

2.4 SMP蛋白标准曲线 8

第三章 不同铁源及电材料对Fe(III)的还原效果的影响 9

3.1引言 9

3.2材料与方法 10

3.2.1 培养基准备 10

3.2.2 实验材料 11

3.2.3仪器 12

3.3 实验设计 12

3.3.1 数据处理 13

3.3.2 测定周期 13

3.4实验分析方法 13

3.4.1分析指标 13

3.4.2 Fe(II)浓度 13

3.4.3黄素 14

3.5 结果与讨论 14

3.5.1 针铁矿及电材料对Fe(III)的还原效果的影响 14

3.5.1.1 溶解态Fe(II) 14

3.5.2 NTA-Fe及电材料对Fe(III)的还原效果的影响 19

3.5.2.1 溶解态Fe(II) 19

3.6 本章小结 24

第四章 不同条件下细菌分泌蛋白的差异 26

4.1引言 26

4.2材料与方法 26

4.2.1 培养基准备 26

4.2.2 实验材料 27

4.2.3仪器 27

4.3 实验设计 28

4.3.1 数据处理 29

4.3.2 测定周期 29

4.4 实验分析 29

4.4.1分析指标 29

4.4.2菌体生长情况 29

4.4.3分泌蛋白浓度 30

4.5结果与讨论 30

4.5.1 菌体生长 30

4.5.2 细菌分泌蛋白 32

第五章结论与展望 34

5.1结论 34

5.2展望 34

第六章 致谢 35

不同铁源及导电材料的添加对Shewanlla puterfaciens CN32铁还原过程的影响

摘 要：异化铁还原菌还原Fe(III)是铁循环及能量流动的重要环节，在微生物的氧化还原反应中，铁氧化物充当电子载体，能够有效的加快微生物对有机物的降解。有研究表明通过补充外源微量元素可以有效提高厌氧微生物活性，铁元素便是外来元素之一。在自然界中有很多细菌可以通过还原矿物中的高价铁以获取能量，其中奥奈达湖希瓦氏菌Shewanella oneidensis是研究最多的异化铁还原菌之一。所以本文以Shewanella puterfaciens CN32为微生物，研究的内容包括：

1.考察了添加导电材料对Fe(III)还原效果的影响，结果显示：以针铁矿为铁源时，添加石墨及CNTs对Fe(III)还原有抑制作用。以NTA-Fe为铁源时，添加石墨及CNTs能够刺激Fe(III)还原。

2.考察了不同铁源下对Fe(III)还原效果的影响，实验结果表明游离态NTA-Fe的Fe(III)还原效果较固定态针铁矿的还原效果好。

3.考察了不同的条件下细菌分泌蛋白的差异，结果表明添加石墨对分泌蛋白有促进作用，添加CNTs对分泌蛋白有抑制作用。

关键词：Shewanella puterfaciens CN32；Fe(III)还原；不同铁源；导电材料；分泌蛋白

The impact of adding different types of iron and conductive material on Shewanlla puterfaciens CN32 iron reduction

Abstract：Bacteria reduction of iron oxide Fe (III) is an important part of iron circulation and energy flow in the oxidation-reduction reaction of microorganisms, the iron oxide acts as an electron carrier, can effectively accelerate the microbial degradation of organic matter.it is shown that by supplementing exogenous trace elements can effectively improve the anaerobic microbial activity, iron is one of foreign elements.There are many bacteria by reduction of ferric minerals for energy in nature, where the Oneida Lake Shewanella Shewanella oneidensis is one of the most studied alienation iron-reducing bacteria.So this paper use Shewanella putrefaciens CN32 as microorganisms, the study include:

1.The effect of adding a conductive material to Fe (III) reduction effect, the results show: the goethite iron source, adding graphite and CNTs to Fe (III) reduction of inhibition. In NTA-Fe is iron source, adding graphite and CNTs can stimulate the Fe (III) reduction.

2.The effects of different iron sources under on Fe (III) reduction effect, the experimental results show that the free state NTA-Fe of Fe (III) reduction effect than the reduction effect of fixed goethite good.

3.The effects of differences in bacterial secreted proteins under different conditions, the results showed that addition of graphite can promote secretion of the protein, adding CNTs to inhibit the secretion of the protein.

Keywords:Shewanella puterfaciens CN32;Fe (III) reduction;secreted proteins; different iron source; a conductive material

第一章 绪论

1.1研究背景

在土壤、沉积物及浅埋藏的环境中，存在着丰富的铁的氧化物（如水铁矿、赤铁矿及针铁矿等）[1,2]，这些铁的氧化物是地球表层中最重要的铁资源。控制了地表系统中的Fe(II)-Fe(III)的氧化还原就等于掌握了铁循环过程及能量流动的重要环节[3.4]，其中含铁矿物的微生物氧化-还原作用越来越受到人们的关注[4，5] 。部分异养厌氧型微生物在进行呼吸作用的同时还可以通过还原 Fe(III)来获得能量，这种铁的异化还原能力在许多生物、地球及化学循环中都起着举足轻重作用[6-10]，也能显著影响重金属污染的生物修复、金属腐蚀的控制及生物质能转化等[11-14] 。所以，Fe(III)的还原是铁的生物、地球及化学循环过程的重要环节。

目前已经发现了自然界中有许多细菌可以通过还原矿物中的高价铁以获取能量 [4] ，其中奥奈达湖希瓦氏菌Shewanella oneidensis是研究最多的异化铁还原菌之一[15-19] 。Shewanella属常见于土壤、沉积物、地表水和地下水，为革兰氏阴性异化金属还原菌，能利用氧气、高价金属以及变价无机盐类作为终端电子受体，获取生长所需能量 [20-23]。从细菌与针铁矿反应过程的研究中显示，在厌氧环境下 Shewanella puterfaciens在针铁矿表面的吸附远强于有氧条件，并且由于细菌表面的还原酶多，可促进电子由细菌向矿物的表面有效转移 [24,25]。对比针铁矿与 +3 价游离铁离子的微生物还原作用，发现细菌易于直接还原游离态的Fe 3+ 离子，而结晶态铁矿物的溶解还原则相对比较困难 [26]。

有研究表明在蓝藻厌氧发酵产沼气是资源化的过程中,通过补充外源微量元素可以有效提高厌氧微生物活性,铁元素便是外来元素之一[28]。亚铁子能够有效的提高产甲烷菌酶的活性,而且铁氧化物是自然界中一种广泛存在且价廉易得的矿物,可以作为一种外源添加物在蓝藻的厌氧发酵中使用。Kato S 研究认为,在微生物的氧化还原反应中,铁氧化物充当电子载体,能够有效的加快微生物对有机物的降解[29]。

1.2国内外研究现状及研究意义

在上世纪70年代国外就已经开始了有关异化Fe(III)还原的研究，研究Fe(III)还原菌的分类、分离、分子机制及极端环境条件下异化Fe(III)还原菌，在研究生命起源及进化中起到重要的意义，异化Fe(III)还原菌应用于放射性核素、石油等碳氢化合物和垃圾渗滤液污染的地下水的原位修复，异化Fe(III)还原菌还在产生微生物燃料电池方面作了大量的原创性工作。虽然目前对Fe(III)还原菌的研究已经做了大量的工作，但是国内在这方面的研究还比较少；国外大多数是关注于海洋、湖泊和沼泽等生态系统的研究，对蓝藻中的Fe(III)还原菌研究却比较少。Fe(III)还原菌的形态多异，营养类型多样。但是目前还没有获得能够为Fe(III) 还原菌通用的功能性基因，这就极大的阻碍了Fe(III) 还原菌在生态系统中的原位研究；如果能够借助于日益先进的生物分子学技术找到功能性基因，这将会大大促进Fe(III)还原菌的研究和其在生物修复方面的应用。我国拥有大面积的湖泊资源，但很多湖泊及河流都受到了蓝藻的污染，所以十分有必要深入了解蓝藻中的Fe(III)还原菌的多样性；且蓝藻是湖泊河流中的一种微生物，是由于大量氮、磷等营养元素的排入而产生的蓝藻爆发。

Fe(III)还原菌既在生态系统中既是碳循环的驱动者，同时又是氮循环的参与者。Fe(III)还原菌如Geobacter除了参与还原铁氧化物外，还参与了NO－3 、依赖型铁Fe(III)还原和Fe(III) - NH+4 很可能也具有与氧化还原耦合的关联。此外，Fe(III)还原菌(Geobacter)还具有固氮酶，而固氮菌（Clostridia）同时也是一种异化Fe(III)还原菌。总之，Fe(III)还原菌与C、N代谢有着密切的联系。深入的研究微生物介导的C-Fe-N耦合的机制，探究Fe(III)还原菌在生态系统中 C、N 代谢的生态意义将会推动整个生态系统的生物地球的化学循环[30]。

Fe(III)还原菌在生物修复中有巨大的潜力，研究Fe(III)还原菌在生物修复中的应用,对开发出既经济又高效的修复途径在人类生态系统的健康发展方面具有重要时代意义。除了通过添加单一的电子供体来刺激Fe(III)还原菌的生长来提高污染物的去除率之外，添加导电材料在Fe(III)还原菌生物修复中的作用机制和应用同时也需要进一步研究。

在自然界之中, Fe(III)能够被生物还原成 Fe2+。不管Fe3+是以溶解态还是固态的形式存在。微生物细胞与固体矿物之间的电子传递是控制岩石圈能量交换的基本过程[27]。Fe(III)不可能与外周胞质蛋白直接结合,因为它们是以难溶的固体形式存在于细胞表面之外,并且在大多数条件下不能通过细胞外膜。但是有一些还原铁氧化物的细菌可以做到这一点,它们通过将相关细胞色素置于细胞外膜外表面使得其接触到氧化物表面从而实现传递电子[27]。还有其他的机制包括生物合成具有电子受体和电子供体特性的水溶性有机化合物充当电子梭促进电子传递[31]。2008 年,Von Canstein 等[32]，报道还原金属的希瓦氏菌属可以分泌核黄素(维生素B2)和黄素单核甘酸(FMN)充当电子梭促进结晶度低的 Fe3+氧化物的还原。

1.3 研究内容

本文采用希瓦氏奥奈达菌（Shewanella puterfaciens CN32，简称 CN-32）CN-32 为研究菌株和人工合成的针铁矿、人工配置的Fe-NTA为两种不同的电子受体，并在不同电子受体的培养基中加入导电材料CNTs或石墨。构建营养充足的、pH 为中性的厌氧环境体系，研究了不同铁源及导电材料的添加对Shewanella puterfaciens CN32铁还原过程的影响研究，讨论了不同铁源及导电材料的添加对Fe(III)的还原效果的影响及不同条件下细菌分泌蛋白的差异。

第二章 Shewanella puterfaciens CN32及测试指标标线

2.1 CN32菌准备

所用菌种为奥奈达湖希瓦氏菌Shewanella puterfaciens CN32由中国海洋微生物菌种保藏管理中心提供(MCCC，编号1A01706)。

培养基：好氧培养基为LB培养基参考《分子克隆实验指南》[33]，pH 7.2。

CN-32菌株的活化、传代和培养均在好养培养基中进行，使用 LB 培养基（10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母膏，10 g/L NaCl）于室温下活化三代。然后进行洗菌和收菌。

2.1.1 收菌方法

燃烧的酒精灯边，12000 rpm,5 min,洗涤3次。需要的仪器：预先灭菌:50mL压盖式离心管（保鲜袋装），1mL移液枪，200mL无机培养基；需提前准备但无需灭菌：冰盒（取冰用），废液缸，酒精灯，打火机。

收菌及洗菌时重悬洗菌的操作方法：（操作必须在酒精灯边，并且每次使用都要用火焰轻燎，保证无菌）离心后弃去上清夜，燃烧的酒精灯边，菌体沉淀中用灭菌过的1mL抢打入5mL无机培养基，反复抽吸直至分散完全，将离心管盖及管口在火焰边轻晃后盖紧离心管进行离心，第3次洗菌可以将菌液用枪合并在一起后进行。

2.1.2测收菌后OD值

取0.1mL浓缩菌，稀释至10mL后用紫外分光光度计测定，波长为600nm.

2.1.3接菌

将所需浓缩菌液按照收菌后的OD值算好，在无氧条件下，用1mL一次性针管取菌也注入灭好菌的厌氧瓶中。

2.2铁标线

试剂：

（1）铁标准储备液：精确称量0.7020g硫酸亚铁铵(（NH4)2Fe(SO4).6H2O ),溶于50mL的（1+1）硫酸中，转移至1000mL的容量瓶中，加水至标线，然后摇匀。此时溶液中每升100μg铁。

（2）铁标准使用液：精确移取25mL铁标准储备液于100mL的容量瓶中，加水至标线，摇匀，此时溶液中每升25μg铁。

（3）（1+3）盐酸。

（4）10%盐酸羟胺溶液。

（5）缓冲溶液：40g乙酸铵加入50mL冰乙酸最后用水稀释到100mL。

（6）0.5%邻菲啰啉（1,10-phenanthroline）水溶液，加入浓盐酸帮助于溶解。

步骤：

依次移取铁标准使用液0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0置于150锥形瓶中，加入蒸馏水至50mL，再加入1mL的（1+3）盐酸，1mL10%盐酸羟胺溶液，之后加入1-2粒玻璃珠。加热煮沸至溶液剩15mL左右，冷却至室温，定量转移至50mL具塞比色管中。加入一小片刚果红试纸，滴加饱和乙酸钠溶液至试纸刚变红，加入5mL缓冲溶液，2mL0.5%邻菲啰啉，加水指标线，摇匀。显色15min后，用10mm比色皿，以水为对照，在510nm处测吸光度。

测得的标线为：

表2.1 铁标线

图2.1 铁标线

2.3菌体生长标准曲线

Bradford蛋白含量检测法标准曲线建立采用牛清蛋白（生工）为蛋白质标准物质，设置10、20、40、80、100及200mg/L等不同浓度。移取0.1mL 0.5mol/L NaOH 溶液加入0.9 mL 蛋白质标准物质，121℃ 下加热20 min 裂解细胞。待充分冷却后，离心悬液（12000rpm,5min），去0.2 mL 上清夜与1 mL Bradfor试剂（生工）混合(1.5 mL离心管内)，利用分光光度计于595 nm 波段读取光度值。

表2.2 菌体生长标线

图2.2菌体生长标线

2.4 SMP蛋白标准曲线

Bradford蛋白含量检测法标准曲线建立采用牛清蛋白（生工）为蛋白质标准物质，设置10、20、40、80、100及200mg/L等不同浓度。移去0.2 mL 上清夜与1 mL Bradfor试剂（生工）混合(1.5 mL离心管内)，利用分光光度计于595 nm 波段读取光度值。

表2.3 菌体分泌蛋白标线

图2.3 SMP蛋白标线

第三章 不同铁源及电材料对Fe(III)的还原效果的影响

3.1引言

近年来Fe(Ⅲ)还原在环境重要性越来越受到人们的关注。Fe(Ⅲ)作为电子受体,通过异化型铁还原菌的异化作用,把Fe(Ⅲ)还原成Fe(II),实现多种有机物的氧化。无论是固定态的Fe(Ⅲ)还是游离态的Fe(Ⅲ)都可以被铁还原菌还原成Fe(II)，相比之下游离态的Fe(Ⅲ)比固定态的Fe(Ⅲ)被还原的效果要好些[34]。电子穿梭体（Electron shuttles）在胞外的Fe(Ⅲ)还原中到重要作用，中性 pH 条件下，当环境中的Fe(Ⅲ)是以不可溶的复合物形式存在时, 这些不可溶复合物中的 Fe(Ⅲ)不易与菌体外膜直接接触。这样，从菌体外膜蛋白到不可溶复合物的Fe(Ⅲ)的电子传递就必须要通过一可溶的中间体来实现，这一中间体通常被叫作电子穿梭体。电子穿梭体能够不断的从外膜蛋白接受电子，之后再把接受的电子传给Fe(Ⅲ)复合物，从而实现Fe(Ⅲ)的还原。

3.2材料与方法

3.2.1 培养基准备

厌氧培养基成分为：20mmol/L 乳酸钠（电子供体），0.46g/L NaCl， 0.255g/L (NH4)SO4，0.024g/L MgSO4·7H2O， 20mmol/L(4.766g/L) HEPES，5mL/L 微量元素储备液，其中添加NTA-Fe及水热合成针铁矿作为不同的电子受体，并在不同电子受体的培养基中加入1g/L 导电材料CNTs或石墨，调节初始pH为7.2，鼓氮气排净瓶内空气，然后用丁基胶塞密封后灭菌。配培养基时需要多配200 mL无机培养基，转入蓝盖试剂瓶，半盖瓶盖后灭菌，保存待洗菌用。培养基体积为100 mL，添加菌的OD值为0.5。不使用维生素，微量元素直接加到无机培养基中。培养基配完后分装到厌氧瓶中，通N2 5分钟后封装，之后于121℃高压蒸汽灭菌，保存待用。

微量元素储备液：

表3.1 微量元素储备液组分

3.2.2 实验材料

菌株：奥奈达湖希瓦氏菌Shewanella puterfaciens CN32。

固定态铁源：人工合成的针铁矿。

游离态铁源：Fe-NTA，根据Reed et al.( 2007)的方法制备[35]。

导电材料：CNTs，325目球形石墨。

3.2.3仪器

表3.2 仪器

3.3 实验设计

采用厌氧瓶为反应体系，体积为100 mL 。实验用针铁矿、NTA-Fe两种铁源，不同铁源设置对照、石墨、CNTs三个实验组，每个实验组分别设置A、B反应体系。6个实验组，共需要12个厌氧瓶，厌氧瓶塞处用丁基胶塞塞住后再用瓶塞拧紧。将这6个实验组置于培养箱中，定期从反应体系中取一定量的混合溶液进行分析、测量。

组成：

表3.3 反应体系组成

实验分组:

表3.4 实验分组

3.3.1 数据处理

实验中所测得的数据需要用Excel进行整理，然后运用Origin8绘制图表。

3.3.2 测定周期

测定周期：12h，24h，36h，48h，60h，84h。

3.4实验分析方法

3.4.1分析指标

液相指标：核黄素、FMN、Fe(II)。

固相指标：HCl提取态Fe(II)。

3.4.2 Fe(II)浓度

离心1mL样品悬液（12000rpm,5min）。溶解态Fe(II)：取0.5mL上清液稀释，1mL稀释液 + 1mL铁缓冲溶液 + 0.4邻菲罗啉，稀释至10mL，显色5-10min,利用分光光度计于510 nm 波段读取光度值。HCl可提取态Fe(II)：沉淀用20mL纯水重悬，取1mL悬液与1mL 1mol/L HCl混合，室温下静置5min，离心（12000rpm,5min），取1mL上清液 + 1mL铁缓冲溶液 + 0.4邻菲罗啉，稀释至10mL，显色5-10min,利用分光光度计于510 nm 波段读取光度值.

3.4.3黄素

在给定的时间间隔内，从厌氧瓶中取出少量混合液，12000rpm,5分钟离心，之后过0.22μm的滤膜。取100μL过膜后的溶液注入到液相色谱中（LC-1100，Agilent Inc.,USA），该液相色谱配置C18columm(Waters Inc.,Ireland)。流动相由25%甲醇和75%醋酸铵（0.05M，去离子水配置，PH 7.0）组成，流量 0.8ml/min。黄素类物质由RF-10AXL荧光检测器（Shimadzu Co.,Japan）在激发波长420nm和发射波长525nm处检测。为了获得标准曲线，由基础培养基配置FMN和RBF（Sigma,Inc.,USA）标准液，标准溶液浓度为0.1到10μM。样品中FMN和RBF的浓度通过与标准面积比较对应峰的积分面积测定。

3.5 结果与讨论

3.5.1 针铁矿及电材料对Fe(III)的还原效果的影响

3.5.1.1 溶解态Fe(II)

研究以针铁矿为铁源添加不同导电材料的实验组，从图3.1中可以看到溶解态的Fe(II)在对照组的浓度要高于石墨组及CNTs组，而石墨组的溶解态Fe(II)的浓度又要比CNTs的高一些。从中我们可以得出结论就是添加石墨和CNTs导电材料对溶解态Fe(II)的浓度溶出有抑制作用，相比之下，添加CNTs组对对溶解态Fe(II)的浓度溶出的抑制效果比石墨的抑制作用较强。在前24小时之内，对照组与石墨组中的溶解态Fe(II)的浓度增长较快，而CNTs组的增长速率较慢，24小时至60小时之间三个实验组的增长速率相差不大，之后CNTs组的溶解态Fe(II)的浓度的增长速度有所加快。从图1中我们可以看到在60-84小时的时候，石墨组的溶解态Fe(II)浓度的增长速率是整个实验中增长速率最快的。

图3.1溶解态Fe(III)浓度

3.5.1.2 HCl可提取态Fe(II)

而从图3.2中可以看到HCl可提取态Fe(II)的浓度变化，相比较我们可以看出添加石墨组中的HCl可提取态Fe(II)的浓度要比对照、CNTs组的高。就HCl可提取态Fe(II)而言，我们可以得出结论就是：添加石墨对HCl可提取态Fe(II)的浓度有促进作用而添加CNTs对HCl可提取态Fe(II)的浓度有抑制作用，但促进效果不是很明显而添加CNTs对HCl可提取态Fe(II)的浓度的抑制效果却比较大。图中可以看到石墨组及CNTs组的HCl可提取态Fe(II)的浓度一直呈现出增长的趋势，对照组的HCl可提取态Fe(II)的浓度整体呈现增长的趋势，但在48小时和84小时的时候浓度却出现了反常。到达实验结束，发现对照组合石墨组的HCl可提取态Fe(II)的浓度相差不多，为3.505mg/L与3.582mg/L。

图3.2 盐酸提取Fe(III)浓度

3.5.1.3 总Fe(II)的浓度

为了更加方便的讨论Fe(III)的还原的效果，我把溶解态Fe(II)的浓度和HCl可提取态Fe(II)的浓度进行相加，得到了总Fe(II)的浓度。并绘制了图3.3（总铁浓度），从图3.3中我们可以从整体中看出添加石墨和CNTs对Fe(III)的还原都有一定的抑制作用，添加CNTs组从反应开始到反应结束，二价铁的浓度相对于对照组都要低。而添加石墨组在前24小时内对Fe(III)的还原效果与对照组的还原效果相差不大，24小时之后添加石墨的实验组才表现出对Fe(III)的还原的抑制作用。从图中我们可以看到在84小时的时候，石墨组的总铁浓度要高于对照组的总铁浓度，对于这个现象的出现，可以用上面所提到的图3.1中石墨组的溶解态Fe(II)的浓度相对于60小时的溶解态Fe(II)的浓度增长速率较大。及图3.2中对照组的HCl可提取态Fe(II)的浓度要低于60小时的HCl可提取态Fe(II)的浓度来解释。

图3.3 总Fe(III)浓度

从针铁矿与导电材料的实验组可以看出：添加CNTs对实验一直是抑制作用，对照组的最高总Fe(II)的浓度为9.245mg/L。石墨组的最高总Fe(II)的浓度为7.826mg/L。CNTs组的最高总Fe(II)的浓度为6.381mg/L。

3.5.1.4 黄素、FMN及RBF

图3.4 RBF浓度

图3.4为针铁矿为铁源的实验组的RBF的浓度，从图中可以看到，RBF的浓度在前12小时增长速率很大分别为。对照组中的RBF浓度在逐渐的增长，到反应结束到达最高浓度为0.219μM。从12小时到60 小时增长速率较低，而从60小时到96小时速率突然增大。石墨组的RBF浓度从小时后开始下降，到达60小时后又突然增长。而CNTs组的RBF浓度也是从12小时后开始下降，但下降到达36小时后又开始缓慢上升，到达60小时后突然增长速率变大。石墨和CNTs的RBF最大浓度都是在12小时的，说明在前12小时添加导电材料的实验组分泌的RBF量最大，添加这两种材料的细菌分泌RBF有一定的抑制作用。

图3.5 FMN浓度

图3.5是以针铁矿为铁源的实验组中的FMN浓度的变化，从图中的整体趋势可以看出添加了石墨和CNTs这两种导电材料之后对FMN的分泌有一定的抑制作用。前12小时，三个实验中的FMN浓度都增长的比较快。同样的对照组中的FMN浓度还是在缓慢的增长，到反应结束最高浓度到达1.7095μM。石墨组在12小时之后开始下降，开始下降缓慢，之后突然下降的很快，但到达60小时到96小时内FMN的浓度突然增长的很快，反应结束FMN的浓度到达最大并且超过了对照组的最大浓度，为1.8585μM。而添加CNTs组的FMN浓度从12小时的最大浓度后就开始下降，然后又开始上升，但上升的趋势不大。

为了更好的讨论细菌分泌的黄素类物质，我把RBF和FMN相加起来，得到了图3.6。

图3.6 flavins浓度

图3.6为两种黄素类物质的加和浓度，从flavins中可以看到添加了石墨及CNTs这两种导电材料后对flavins的分泌有一定的抑制作用，前12小时，三个实验中的flavins浓度都增长的比较快。对照组中的flavins浓度还是在缓慢的增长，到96小时到达最高浓度为1.9285μM。石墨组在12小时之后开始下降，开始下降缓慢，之后突然下降的很快，但到达60小时到96小时内flavins的浓度突然增长的很快，反应结束flavins的浓度到达最大并且超过了对照组的最大浓度，为2.024μM。而添加CNTs组的FMN浓度从12小时的最大浓度后就开始下降，然后从36小时后开始上升，但上升的趋势不大。

3.5.1.5讨论

对于针铁矿为铁源的实验组，添加石墨及CNTs对Fe(III)的还原效果有一定的抑制作用，而CNTs的抑制作用比石墨的作用要大。针铁矿是固态铁源，在体系中Fe(III）从电子供体中通过细菌传递电子而接受电子，从而实现Fe(III)还原，还原成的Fe(II)在反应体系中是以溶解态Fe(II)和盐酸可提取态Fe(II)的形式存在。到停止实验的时候，对照组、石墨组及CNTs组中的浓度为最高浓度，各为9.245mg/L、7.826mg/L、6.381mg/L，对照组中总Fe(II)浓度比石墨组多18.1%，对照组比CNTs组总Fe(II)浓度多44.9%。针铁矿的还原是属于生物过程，同时也担任着电子受体的作用。导电材料在胞外不可溶的 Fe(III)还原过程中起着重要作用，环境中的三价铁一般是以不可溶的形态存在，这样的三价铁不易与菌体外膜直接接触，电子穿梭（Electron shuttler）等物质的作用是要不断的从外膜蛋白接受电子，再把接受的电子传给三价铁的复合物，从而实现三价铁的还原[36]。

Shewanella puterfaciens CN32可以分泌两种黄素类物质，FMN和RBF，在本实验中可以看出黄素类物质主要是以FMN。有实验研究分泌黄素类物质对针铁矿还原的贡献，他们的测试条件下检测下得到RBF为主要的物质[34]。FMN和RBF的浓度与细菌生长的速率有关，从菌体生长曲线中看出：前12细菌增长速率大，所以黄素类物质在前12小时前增长的速率也比较大。实验中RBF在对照、石墨、CNTs中的最大浓度各位0.219μM、0.1675μM、0.0665μM，FMN在对照、石墨及CNTs中的最大浓度则为1.7095μM、1.8585μM、0.331μM。FMN在对照、石墨及CNTs在黄素类物质中个占了88.6%、91.8%、83.3%。大多数希瓦氏菌属可以分泌黄素类物质作为electron shuttler，而electron shuttler可能帮助一些电子供体将电子转移到细胞，所以黄素类物质在希瓦氏菌的胞外电子传递过程中具有不可或缺的作用，Fe(III）还原与黄素的功能密切相关[34]。从flavins中的浓度可以看出添加CNTs对黄素分泌有抑制作用，从而使添加CNTs在针铁矿为铁源时对Fe(III）还原效果也有抑制作用。

3.5.2 NTA-Fe及电材料对Fe(III)的还原效果的影响

3.5.2.1 溶解态Fe(II)

研究以NTA-Fe为铁源添加不同导电材料的实验组，我们从图3.7中可以看到溶解态Fe(II)的浓度在石墨组及CNTs组的浓度都要高于对照组，而CNTs组溶解态Fe(II)的浓度要比石墨组的溶解态的Fe(II)的浓度高一些。单从溶解态的Fe(II)浓度中我们可以得出结论就是添加石墨和CNTs导电材料对溶解态的Fe(II)浓度有促进作用。由于NTA-Fe是游离态的，所以12小时测得的溶解态的Fe(II)的浓度要高，之后逐渐转化为HCl可提取态Fe(II)。在24小时、36小时及60小时中我们可以看到溶解态的Fe(II)的浓度都低于12小时及48小时的浓度，这是都是因为溶解态Fe(II)与HCl可提取态Fe(II)相互转换的结果，所以溶解态Fe(II)的浓度就呈现出上升随后下降的趋势。

图3.7 溶解态Fe(III)浓度

3.5.2.2 HCl可提取态Fe(II)

而从图3.8中可以看到HCl可提取态Fe(II)的浓度变化，相比较我们可以看出添加CNTs组中的HCl可提取态Fe(II)的浓度要比对照、CNTs组的高，单从HCl可提取态Fe(II)来看，我们可以得出结论就是：添加CNTs对HCl可提取态Fe(II)有促进作用。从图3.8中我们可以看到在48小时的时候，CNTs组的HCl可提取态Fe(II)的浓度达到最大浓度，最高浓度为4.945mg/L。而石墨与对照组达到最大浓度的时间为60小时，最高浓度分别为3.828mg/L、3.977mg/L。由此可见添加CNTs能够促进反应的进行，加快了反应的速率。在前24小时内，石墨组的HCl可提取态Fe(II)的浓度要比对照组的要高，之后对照组的HCl可提取态Fe(II)的浓度反而超过了石墨组的浓度。由于NTA-Fe为溶液，所以在测HCl可提取态Fe(II)的时候有可能存在部分的溶解态Fe(II)以及实验上的误差，因此可能存在图3.5中对照组108小时的HCl可提取态Fe(II)突然比石墨组的浓度低。

图3.8 盐酸提取态Fe(III)浓度

3.5.2.3 总Fe(II)的浓度

为了方便的讨论Fe(III)的还原的效果，我同样把溶解态Fe(II)的浓度和HCl可提取态Fe(II)的浓度进行了整理，得到总Fe(II)的浓度。并绘制了图3.9（总铁浓度）。总铁浓度的变化毫无规律可言，但三个实验组的变化规律是一样的，都是呈现出现上升后下降再上升又下降的趋势。在24小时、36小时及60小时中可以看到总Fe(II)的浓度要低于12小时及48小时的浓度，同样的还有12小时测得的总Fe(II)的浓度较高。对照组最高浓度为12小时，133.328mg/L，之后总Fe(II)的浓度就在一定浓度范围内波动，最后浓度到达一个平衡点。而石墨组在12小时的浓度也较高为123.542mg/L，之后就下降，进过一天的反应后便到达这个实验组的最高浓度为149.747mg/L，之后总Fe(II)的浓度就在一定浓度范围内波动，最后总Fe(II)的浓度到达平衡点。添加CNTs组在12小时时总Fe(II)的浓度也较高为154.566mg/L。和石墨组的情况一样，到48小时时浓度到达最高，最高为157.4mg/L，之后浓度又下降，最后到达浓度的平衡。这三个实验组总Fe(II)的浓度随时间的变化趋势是同步的，对于实验为什么会出现这样的情况，暂时还不能解释。但从图6中我们可以从整体中添加石墨和CNTs对Fe(III)的还原都有一定的促进作用。CNTs对Fe(III)的还原效果的促进作用更好。

图3.9 总Fe(III)浓度

3.5.2.4 黄素、FMN及RBF

图3.10为NTA-Fe实验组为铁源中的RBF的弄得变化。对照组、石墨组及CNTs组的RBF浓度在前12小时内都快速增加，都达到了最高浓度分别为1.0525μM、0.9735μM、0.756μM。之后每个实验组的RBF浓度都在逐渐的减少，石墨组的RBF浓度在每个时间段上都在CNTs和对照组的RBF浓度之间。从RBF来看添加石墨和CNTs这两种导电材料对RBF的分泌有抑制作用，而CNTs对细菌分泌RBF的抑制作用更强。

图3.10 RBF浓度

图3.11是以NTA-Fe为铁源添加不同导电材料的FMN的浓度。从图中可以看出添加石墨和CNTs这两种导电材料对FMN的分泌都有抑制作用，而添加CNTs对细菌分泌FMN的抑制作用要强一些。对照组、石墨组及CNTs组的RBF浓度在前12小时内都快速增加，都达到了最高浓度分别为5.1395μM、5.192μM、3.933μM。之后每个实验组的RBF浓度都在逐渐的减少，到达36小时后，各组的FMN浓度都急剧下降。

图3.11 FMN浓度

为了更方便的讨论细菌分泌黄素类物质的能力，我把NTA-Fe为铁源中的RBF和FMN浓度进行加和，得到了flavins浓度图。

图3.12 flavins浓度

从图中可以看出添加石墨和CNTs这两种导电材料对flavins的分泌都有抑制作用，而添加CNTs对细菌分泌flavins的抑制作用要强一些。由于flavins是由RBF和FMN浓度的加和，因为FMN的浓度要比RBF浓度大的多，所以flavins的图形变化趋势和FMN浓度图的变化趋势一样。

3.5.2.5 讨论

对 Fe(III)还原是一个由微生物介导的氧化还原反应，因此影响到 Fe(III)还原的因素有Fe(III)还原微生物种类、Fe(III)的形态、电子供体和电子受体的种类以及其它的环境条件。在以NTA-Fe为电子受体的实验中，可以看出我们添加的不同导电材料石墨及CNTs对Fe(III)还原有一定的促进作用，且添加CNTsFe(III)还原的效果更好。导电材料可以将电子从电极传递到细胞，同时也可以加速电子从细胞到电子受体的传递，所以导电材料对Fe(III)的还原效果既有抑制作用的，同时对Fe(III)的还原效果也有促进作用的[34]。NTA-Fe是游离态的铁源，在体系中Fe(III）从电子供体中通过细菌传递电子而接受电子，从而实现Fe(III)还原，还原成的Fe(II)在反应体系中是以溶解态Fe(II)和盐酸可提取态Fe(II)的形式存在。

Shewanella puterfaciens CN32可以分泌两种黄素类物质，FMN和RBF，在以NTA-Fe铁源的实验中可以看出黄素类物质主要是FMN。已有文章提到水铁矿抑制FMN和RBF的分泌，而Fe(III)-NAT对FMN和RBF的分泌有刺激作用，由于其高溶解度，Fe(III)-NAT可以被Shewanella puterfaciens CN32迅速还原，与水铁矿相比会导致更高的能量产生。这可能解释Fe(III)-NAT对黄素类物质分泌的刺激效应，该效应可能是一个依赖能量的过程[34]。Flavins的浓度图中，可以看出对照组的Flavins浓度都要高于石墨组和CNTs组，这说明了添加这两种导电材料对Flavins的分泌有抑制的效果。按理说铁还原的效果也应该与黄素类物质的浓度变化趋势一样，但实际上是添加石墨和CNTs对Fe(III)的还原有促进作用。由于个人时间和能力有限，没能找出为什么出现这样的原因。

3.6 本章小结

本章是研究不同铁源及添加导电材料对Fe(III)还原效果影响的研究，从实验的结果来看，得出：以针铁矿为铁源，添加石墨及CNTs对Fe(III)还原有一定的抑制作用。而以NTA-Fe为铁源时，添加石墨及CNTs对Fe(III)还原有促进作用。在细菌 Fe(Ⅲ) 呼吸链的电子传递途径过程中；电子由电子供体向醌类中间体的传递、电子从醌类( MQ)中间体传给 CymA、由 CymA 向周质细胞色素的传递、电子由周质传到外膜蛋白、细胞外膜的末端还原酶把电子交给 Fe(Ⅲ)[30]。所以导电材料对Fe(III)还原效果的影响差异很大，且影响的途径之多，所有就会产生不同的效果。

实验初期铁（III）源都是10mM，被还原成Fe(II)后，对照组的Fe(II)最高浓度分别为：针铁矿 9.245mg/L、NTA-Fe 133.328mg/L。石墨组的Fe(II)最高浓度分别为：针铁矿 7.826mg/L、NTA-Fe 149.747mg/L。CNTs组的Fe(II)最高浓度分别为：针铁矿 6.381mg/L、NTA-Fe 157.4mg/L。从上面的数据中我们可以看出，以NTA-Fe为铁源比以针铁矿以铁源对Fe(III)还原效果更好。之前已有对硝酸抑制铁(III)还原的报道，硝酸盐呼吸会明显抑制铁还原[37]。当电子供体足够的条件下TMAO呼吸可能不会妨碍铁还原[38]。所以可得出不同的电子受体对铁还原的效果不一，本实验只是研究了两种不同电子受体对Fe(III)还原效果影响，铁还原对环境有着重要的作用，所以研究电子受体对铁还原还需要进一步的调查与研究。

第四章 不同条件下细菌分泌蛋白的差异

4.1引言

分泌蛋白质是指由组织、细胞等分泌的蛋白质，分泌蛋白(secretory Protein)参与细胞传导信号、细胞的增殖、分化及凋亡的调控和生物体发育等主要的生命过程。了解不同发育、不同生理、病理条件、生长时期和不同类型的细胞分泌蛋白的表达特点对认识生命过程具有重大意义。分泌蛋白的研究能够有助于直接找到与特定生理状态相关的生物分子，分泌蛋白的研究可以深入阐释生命活动规律。在自然界中，几乎所有的生理过程与环境因子的作用都依赖于分泌蛋白，并能引起蛋白质的变化。所以，对蛋白质变化的分析能为上述过程和结果提供重要的信息。分泌蛋白质对于细菌的生长及繁殖起到至关重要的作用[39]。

4.2材料与方法

4.2.1 培养基准备

厌氧培养基成分为：20mmol/L 乳酸钠（电子供体），0.46g/L NaCl， 0.255g/L (NH4)SO4，0.024g/L MgSO4·7H2O， 20mmol/L(4.766g/L) HEPES，5mL/L 微量元素储备液(Kato et al., 2010)，其中添加NTA-Fe及水热合成针铁矿作为不同的电子受体，并在不同电子受体的培养基中加入1g/L 导电材料CNTs或石墨，调节初始pH为7.2，鼓氮气排净瓶内空气，然后用丁基胶塞密封后灭菌。配培养基时需要多配200 mL无机培养基，转入蓝盖试剂瓶，半盖瓶盖后灭菌，保存待洗菌用。培养基体积为100 mL，添加菌的OD值为0.5。不使用维生素，微量元素直接加到无机培养基中。培养基配完后分装到厌氧瓶中，通N2 5分钟后封装，之后于121℃高压蒸汽灭菌，保存待用。

微量元素储备液：

表4.1 微量元素储备液组分

4.2.2 实验材料

固定态铁源：人工合成的针铁矿。

游离态铁源：Fe-NTA，根据Reed et al.( 2007)的方法制备[35]。

导电材料：SWCNTs，325目球形石墨。

4.2.3仪器

表4.2 仪器

4.3 实验设计

采用厌氧瓶为反应体系，体积为100 mL 。实验用针铁矿、NTA-Fe两种铁源，不同铁源设置对照、石墨、CNTs三个实验组，每个实验组分别设置A、B反应体系。6个实验组，共需要12个厌氧瓶，厌氧瓶塞处用丁基胶塞塞住后再用瓶塞拧紧。将这6个实验组置于培养箱中，定期从反应体系中取一定量的混合溶液进行分析、测量。

组成：

表4.3 反应体系组成

实验分组:

表4.4 实验分组

4.3.1 数据处理

实验中所测得的数据需要用Excel进行整理，然后运用Origin8绘制图表。

4.3.2 测定周期

测定周期：12h，24h，36h，48h，60h，84h。

4.4 实验分析

4.4.1分析指标

液相指标：SMP蛋白质、消解测蛋白。

4.4.2菌体生长情况

采用检测蛋白含量法来表征细胞浓度的变化。Bradford蛋白含量检测法具体步骤为，移取0.1mL 0.5mol/L NaOH 溶液加入0.9 mL 样品悬液中，121℃ 下加热20 min 裂解细胞。待充分冷却后，离心悬液（12000rpm,5min），去0.2 mL 上清夜与1 mL Bradfor试剂（生工）混合(1.5 mL离心管内)，利用分光光度计于595 nm 波段读取光度值。

4.4.3分泌蛋白浓度

离心0.7mL样品悬液（12000rpm,5min），取0.2mL上清夜与1mL Bradford试剂（生工）混合(1.5 mL离心管内)，利用分光光度计于595 nm 波段读取光度值

4.5结果与讨论

4.5.1 菌体生长

图 4.1菌体生长浓度

以针铁矿为铁源添加不同导电材料为实验组，从图4.1中我们可以看出反应体系中菌体的变化情况。反应体系中的初始菌体浓度为140.231mg/L。由于细菌是实验衰亡期的菌，在遇到合适的培养基时就会快速的增长，所以前12小时内三个实验组的细菌都快速的增长，12小时过到60小时之间细菌在缓慢的增长，但对照组的增长趋势是上下波动的。到达60小时之后，三个实验组的菌体浓度都快速下降，到反应结束时间三个实验组的菌体浓度分别为102.045mg/L、97.168mg/L、81.065mg/L。

以NTA-Fe为铁源添加不同导电材料为实验的实验组。图4.2是NTA-Fe为铁源的三个实验组的菌体生长浓度图，从图中可以看出菌体的初始浓度也为140.231mg/L。在整体的反应体系中可以看出菌体的浓度呈增长的趋势，12小时内对照实验组的菌体浓度最大，为158.634mg/L。

图 4.2 菌体生长浓度

之后先开始下降，下降到150.997mg/L。最后从36小时到60小时后开始快速增长，最后增长到了176.669mg/L。而石墨、CNTs实验组的菌体浓度一直都呈增长的趋势，从一开始石墨组的菌体浓度一直都高于CNTs实验组的浓度，但到实验结束时CNTs实验组的菌体浓度却高出了石墨组，高出1.656mg/L。

由于以NTA-Fe为铁源添加不同导电材料为实验的实验组所测定的时间为60小时，对于以针铁矿为铁源添加不同导电材料为实验组所出现的菌体浓度快速下降，在以NTA-Fe为铁源添加不同导电材料为实验的实验组中没能看到。假如延长实验的时间，也一定能看到菌体浓度的下降。因为到反应体系中营养物质的消耗，越来越不适合菌体生长的条件，所以菌体的浓度就会有所降低。从菌体浓度来看，针铁矿、NTA-Fe分别为铁源，两个实验的最高菌体浓度都在170mg/L左右，所以针铁矿、NTA-Fe分别为铁源对菌体的生长影响不大。铁源也是微生物生长所需的微量元素，因为在整个反应体系中所加的铁源都是10mM，可能是Shewanella puterfaciens CN32的生长与铁源的状态关系不大，至于铁源的含量有关。从而在不同铁源菌体生长的浓度变化不大。

在针铁矿组，我们可以看出添加石墨对菌体的生长有促进作用，而添加CNTs对菌体生长却有抑制的作用。但在NTA-Fe组实验组里，从整体来看添加石墨和CNTs对菌体生长都有一定的促进作用。石墨和CNTs在反应体系中不仅充当了Fe(III)的导电材料，而且还充当了微生物生长的C源，碳源在构成微生物细胞的骨架及提供微生物生长、运动和繁殖所需要的能量中起到重要的作用[40]。因为石墨和CNTs中碳的含量不一样、碳原子的排列方式也不一样，所以其性质也不同，就出现了上述的添加不同C源菌体生长不一的情况。

4.5.2 细菌分泌蛋白

图4.3是以针铁矿为碳源添加不同导电材料为实验组的SMP蛋白的浓度，从图中看到对照组、石墨组及CNTs组中的SMP蛋白的浓度在前24小时内快速增长。对照组从一开始快速的增长之后，就呈现缓慢的增长，但在60小时的时候，SMP蛋白的浓度出现了轻微的下降，但之后就开始上升。石墨组的SMP蛋白浓度和对照组的SMP蛋白浓度变化趋势一样。CNTs组的SMP蛋白浓度是呈现出上下波动的增长趋势，同样的在60小时时也出现了突然下降，在到达84小时之后突然出现了快速增长的趋势，到实验停止时达到最高浓度为24.038mg/L。对于三个实验组出来了在60小时时的SMP蛋白突然下降，可以参考菌体生长的浓度了解释。在60小时的时候我们发现菌体生长的浓度是最大的，就是说在60小时的时候细菌吸收的营养物质用于合成自身的生长所需的物质，从而使SMP蛋白的浓度降低。

图4.3 SMP蛋白浓度

图4.4是以NTA-Fe为铁源添加不同导电材料是实验组中的SMP蛋白的浓度变化。24小时内对照组的SMP蛋白浓度在小幅度的增长，在24至48小时内SMP蛋白的浓度快速增长，就24小时的时间差内从8.44mg/L增加到了33.759mg/L，增加了25.319mg/L，之后就先上升随后下降。同样的情况也在石墨组中出现，从24小时的7.008mg/L到48小时的34.965mg/L，增加了27.957mg/L。而对于CNTs组，SMP蛋白的浓度从一开始到48小时内都在缓慢的增长，最高浓度为9.947mg/L，之后就开始下降，下降到5.199mg/L，到84小时后又开始上升，实验结束时SMP蛋白的浓度为9.495mg/L。

图4.4 SMP蛋白浓度

从图中可以看出添加CNTs对SPM蛋白有抑制作用，而添加石墨与对照组相比，有的时间段内对照组的SPM蛋白浓度要高于石墨组，但有的时候石墨组的SPM蛋白浓度又要高于对照组，所有石墨组对SPM蛋白的分泌作用不是很明显。从不同铁源来看，发现NTA-Fe的对照组和石墨的SPM蛋白浓度要高于针铁矿组的，而CNTs组中以针铁矿为铁源的实验组中的SPM蛋白浓度要高于NTA-Fe为铁源的实验组。蛋白质在Shewanella puterfaciens CN32分泌黄素类物质的过程中扮演了一个至关重要的角色[41]，这类蛋白质的功能已被证明是能量依赖型的[42]。所以SMP分泌蛋白对Fe(III)的还原有间接的作用。由于能力有限，没能分析其机制。

第五章结论与展望

5.1结论

本实验是研究不同铁源及导电材料的添加对Fe(III)还原效果的影响。以游离态NTA-Fe为铁源时比固定态针铁矿铁源时的Fe(III)还原效果好。针铁矿的平均铁还原率为1.4%。NTA-Fe的平均铁还原率为26.2%。以针铁矿为铁源时，添加导电材料石墨及CNTs与对照组相比，Fe(III)的还原效果反而较差。以NTA-Fe为铁源时，添加石墨及CNTs的铁还原效果要比对照组好。不同铁源，添加石墨与对照组相比，SMP蛋白的浓度差异都不大，但总体趋势是有一定的促进作用的，而CNTs的添加却抑制SMP蛋白的分泌。这项工作意味着Fe(III)还原可能会受到各种环境因素的影响。特别的，环境中的不同铁源对Fe(III)还原影响可能是很大的，值得进一步研究与调查。

5.2展望

在大四一学期的期间，由于本人能力有限以及实验条件所限，Fe(III)还原在生物修复中具有重大的意义，而Fe(III)还原是属于生物过程，其会受到各种环境因素及条件的影响，许多研究内容可深入和细化研究，在本研究的基础上，未来，可以从以下方面进行开展工作:

（1）本实验只研究了一个浓度下的导电材料，日后可以研究不同浓度梯度下导电材料对Fe(III)还原效果的影响。

（2）进一步研究导电材料在厌氧条件下对Fe(III)还原的影响，通过电化学的方法去研究导电材料的存在是否改变了体系中的电子接受与供给能力,从而推导出导电材料的作用机理。

（3）对Shewanella puterfaciens CN32分泌黄素类物质进一步的研究，研究其对Fe(III)还原的影响。

（4）研究其他希瓦氏菌对Fe(III)还原效果的影响，找出最利于Fe(III)还原的菌株。

第六章 致谢

大学四年的生活很快就要走入尾声，我在工大校园生活就要划上句号，心中有无数的难舍与眷恋。从这里走，对我的人生来讲，将是踏上一个新征程的开始，要把所学的知识应用到接下来三年的研究生学习中去。

回首过去四年，取得了一些成绩，生活中既有快乐也有艰辛。在这里要感谢老师这四年来对我孜孜不倦的教诲，对我的关心及爱护。同学情深，情同兄妹，四年的时光，我们一同走过，充满着关爱，这便是给我留下的最值得珍藏的美好记忆。在我十几年求学历程中，离不开父母的支持和鼓励，他们辛勤的劳作，无私的奉献，为我创造了良好的学习条件，这才使我能顺利完成学业，非常感激他们一直以来对我的支持与培育。

在论文即将完成之际，特别感谢我的指导岳正波老师的热情的关怀和悉心的指导。在我撰写毕业论文的过程中，感谢岳老师倾注了大量的时间与精力，无论是在实验的选题、构思和设计方面，还是在实验的研究方法以及论文成文定稿方面，我都得到了不少岳老师细致的教诲和无私的帮助。特别是他渊博的学识、深厚的文学素养、严谨的教学精神和一丝不苟的工作作风使我终生受益，在此表我真诚的感谢及深深的谢意。 在实验论文的撰写过程中，同学们也给了我不少的宝贵建议，同时还有学姐、学长的支持与帮助，在此一并致以诚挚的谢意。 感谢所有关心、支持及帮助过我的老师、同学及师兄师姐。 最后，衷心地感谢各位专家在百忙之中抽出时间来对本文进行评审及提出宝贵意见。

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