维生素A的测定 - 紫外分光光度计法

维生素A的测定——紫外分光光度计法

维生素A是由β-紫罗酮与不饱和一元醇所组成的一类化合物及其衍生物的总称，包括视黄醇和3-脱氢视黄醇。

一、紫外分光光度法测定维生素A的原理

维生素A的异丙醇溶液在325nm波长下有最大吸收峰，其吸光度与维生素A的含量成正比。

该法的灵敏度较高，可测定维生素A含量低于5μg/g的样品。主要缺点是在最大吸收波长325nm附近许多其他化合物等纯度较高的样品。对于一般样品，测定前必须先将脂肪抽提出来进行皂化，萃取其不皂化部分，再经柱层析除去干扰物。

二、试剂

（1）维生素A标准溶液：

视黄醇（纯度85%）或视黄醇乙酸乙酯（纯度90%）经皂化处理后使用。取脱醛乙醇溶液维生素A标准品，使其浓度大约为1mg/ml视黄醇。临用前以紫外分光光度法标定其准确浓度。

（2）异丙醇

三、测定方法

1、标准溶液的绘制：分别取维生素A标准溶液（每毫升含10I.U）0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，于10毫升棕色容量瓶中，用异丙醇定容。以空白液调仪器零点，于紫外分光光度计上在325nm处测定其吸光度，从标准曲线上查出相当的维生素A含量。

2、样品测定：称取适量的样品，进行皂化。提取、洗涤、脱水、蒸发溶剂后，迅速用异丙醇溶解并移入50ml容量瓶中，用异丙醇定容，于紫外分光光度计325nm处测定其吸光度，从标准曲线上查出相当的维生素A含量。

（1）皂化：称取0.5～5g经组织捣碎机掏碎或充分混匀的样品于三角瓶中，加入10ml1：1氢氧化钾及20～40ml乙醇，在电热板上回流30分钟。加入10ml水，稍稍振摇，若无浑浊现象，表示皂化完全。

（2）提取：将皂化液移入分液漏斗。先用30ml水分两次冲洗皂化瓶（如有渣子，用脱脂棉滤入分液漏斗），再用50ml乙醚分两次冲洗皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗中，振摇2分钟（注意放气），提取不皂化部分。静止分层后，水层放入第二分液漏斗。皂化瓶再用30ml乙醚分两次冲洗，洗液倾入第二分液漏斗，振摇后静止分层，将水层放入第三分液漏斗，醚层并入第一分液漏斗。如此重复操作，直至醚层不再使三氯化锑—三氯甲烷溶液呈蓝色为止。

（3）洗涤：在第一分液漏斗中。加入30ml水，轻轻振摇，静止片刻后，放入水层。再加入15～20ml0.5mol/L的氢氧化钾溶液，轻轻振摇后，弃去下层碱液，（除去醚溶性酸皂）。继续用水洗涤，至水洗液不再使酚酞变红为止。醚液静置10～20分钟后，小心放掉析出的水。

（4）浓缩：将醚液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25ml乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。用水溶蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约5ml乙醚时取下。减压抽干，立即准确加入一定量三氯甲烷（约5ml左右），使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内（3～5μg/ml）。

四、结果的计算

维生素A（I.U/100g）=（C×V）/m×100

式中：C——由标准曲线查得的维生素A含量，I.U/ml；

V——样品的异丙醇溶液体积，ml；

m——样品质量，g；