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蛋白质的提取和检测第一节细胞总蛋白的提取及含量测定【基本原理】蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）和二辛可宁酸法（BCA法）。值得注意的是，上述方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定有可能得出不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。Lowry法：蛋白质和碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下和磷钼钨酸反应并产生深蓝色，在750nm有最大光吸收值。在一定浓度范围内，反应液颜色的深浅和蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。Bradford法：蛋白质和染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量和反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。BCA（Bicinchoninicacid）法：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（Biuretreaction）并和BCA相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。1
【试剂配制】1.1.74mg/ml（10mmol/L）PMSF：0.174gPMSF溶解于100ml异丙醇，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。2.细胞裂解液：50mMTris-HCl（pH7.4），150mMNaCl，1mMPMSF，1mMEDTA，1%TritonX-100，4℃保存。3.100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）：BSA0.1g，0.15mol/LNaCl1ml，充分溶解后-20℃保存。4.0.15mol/LNaCl：0.877gNaCl溶解于100ml去离子水，高温灭菌后室温保存。5.考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250100mg，95%乙醇50ml，磷酸100ml，加去离子水至1L。先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和去离子水，混匀后滤纸过滤，4℃保存。6.PBS缓冲液（pH7.4）：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4•12H2O3.63g，KH2PO40.24g，溶解于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加去离子水定容至1L，常温保存备用。【操作步骤】一、细胞总蛋白的提取1.人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和食道癌细胞系EC109于含10%FBS的DMEM培养基，37℃、