蛋白质变性后的方面

蛋白质变性后的方面

（一）生物活性丧失

　　蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。

（二）某些理化性质的改变

　　蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。

（三）生物化学性质的改变

　　蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。

DNA变性

　　DNA变性指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。

　　变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变： 1）溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。2）溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。 3）增色效应(hyperchromic effect)。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。

各类连接键，结构稳定的键

多肽链中氨基酸残基的构成以及排列顺序称为氨基酸的一级结构,连接一级结构的键是肽键。氨基酸的二级结构是指氨基酸主链原子的局部空间结构,并不涉及氨基酸残基侧链构象,二级结构的种类有α-螺旋、β-折叠、β-转角儿以及无规卷曲。氢键是维系二级结构最主要的键。三级结构是指多肽链主链以及侧链原子的空间排布。次级键维持其稳定, 最主要的键是疏水键。四级结构是指两条以上具有三级结构的多肽链之间缔合在一路的结构。其中每条具有三级结构的多肽链称为亚基,一般具有四级结构的氨基酸才有生物科学活性。维持其稳定的是次级键,如氢键、盐键、疏水键、范德华力等。

离子交换层析 利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定ＰＨ时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。

凝胶层析

　　凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。单个凝胶珠本身象个"筛子"。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。

凡是能降低酶促反应速度，但不引起酶分子变性失活的物质统称为酶的抑制剂。按照抑制剂的抑制作用，可将其分为不可逆抑制作用和可逆抑制作用两大类。

　　⑴不可逆抑制作用：

　　抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。如果以ν～[E]作图，就可得到一组斜率相同的平行线，随抑制剂浓度的增加而平行向右移动。酶的不可逆抑制作用包括专一性抑制（如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制）和非专一性抑制（如路易斯气对巯基酶的抑制）两种。

　　⑵可逆抑制作用：

　　抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制，且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制作用就是可逆抑制作用。如果以ν～[E]作图，可得到一组随抑制剂浓度增加而斜率降低的直线。可逆抑制作用包括竞争性、反竞争性和非竞争性抑制几种类型。

　　① 竞争性抑制：抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低，这种作用就称为竞争性抑制作用。其特点为：a.竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参数：Km值增大，Vm值不变。典型的例子是丙二酸对琥珀酸脱氢酶（底物为琥珀酸）的竞争性抑制和磺胺类药物（对氨基苯磺酰胺）对二氢叶酸合成酶（底物为对氨基苯甲酸）的竞争性抑制。

　　② 反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。其特点为：a.抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；b.必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；c.动力学参数：Km减小，Vm降低。

　　③ 非竞争性抑制：抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ES复合物结合，使酶的催化活性降低，称为非竞争性抑制。其特点为：a.底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；b.抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；c.动力学参数：Km值不变，Vm值降低。

激活剂对反应速度的影响

　　能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。酶的激活剂大多数是金属离子，如K+、Mg2+、Mn2+等，唾液淀粉酶的激活剂为Cl-。

呼吸链包含15种以上组分，主要由4种酶复合体和2种可移动电子载体构成。其中复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、辅酶Q和细胞色素C的数量比为1：2：3：7：63：9。

1.复合体Ⅰ 即NADH：辅酶Q氧化还原酶复合体，由NADH脱氢酶（一种以FMN为辅基的黄素蛋白）和一系列铁硫蛋白（铁—硫中心）组成。它从NADH得到两个电子，经铁硫蛋白传递给辅酶Q。铁硫蛋白含有非血红素铁和酸不稳定硫，其铁与肽类半胱氨酸的硫原子配位结合。铁的价态变化使电子从FMNH2转移到辅酶Q。

2.复合体Ⅱ 由琥珀酸脱氢酶（一种以FAD为辅基的黄素蛋白）和一种铁硫蛋白组成，将从琥珀酸得到的电子传递给辅酶Q。

3.辅酶Q 是呼吸链中唯一的非蛋白氧化还原载体，可在膜中迅速移动。它在电子传递链中处于中心地位，可接受各种黄素酶类脱下的氢。

复合体Ⅲ 辅酶Q：细胞色素C氧化还原酶复合体，是细胞色素和铁硫蛋白的复合体，把来自辅酶Q的电子，依次传递给结合在线粒体内膜外表面的细胞色素C。

细胞色素类 都以血红素为辅基，红色或褐色。将电子从辅酶Q传递到氧。根据吸收光谱，可分为三类：a,b,c。呼吸链中至少有5种：b、c1、c、a、a3(按电子传递顺序)。细胞色素aa3以复合物形式存在，又称细胞色素氧化酶，是最后一个载体，将电子直接传递给氧。从a传递到a3的是两个铜原子，有价态变化。

复合体IV：细胞色素C氧化酶复合体。将电子传递给氧。

固定化酶的概念制备方法及优点　

固定化酶：水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。

优点：固定化酶（immobilized enzyme）不溶于水的酶。是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。

制备方法：固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物生物技术在医药方面的应用

　　目前，医药卫生领域是现代生物技术应用得最广泛、成绩最显著、发展最迅速、潜力也最大的一个领域。

　　疾病预防

　　利用疫苗对人体进行主动免疫是预防传染性疾病的最有效手段之一。注射或口服疫苗可以激活体内的免疫系统，产生专门针对病原体的特异性抗体。

　疾病诊断

　　生物技术的开发应用，提供了新的诊断技术，特别是单克隆抗体诊断试剂和DNA诊断技术的应用，使许多疾病特别是肿瘤、传染病在早期就能得到准确诊断。

　疾病治疗

　　生物技术在疾病治疗方面主要包括提供药物、基因治疗和器官移植等方面。

　　利用基因工程能大量生产一些来源稀少价格昂贵的药物，减轻患者的负担。这些珍贵药物包括生长抑素、胰岛素、干扰素等等。

酶催化高效性的基本原理

首先，酶的催化作用是因为它能够降低反应活化能。因为它能够稳定反应的过渡态中间物。具体来说，①定向效应和邻近效应（定向效应是把反应底物按一定方向排列，邻近效应是把底物拉到一起，这样反应更加方便）②酸碱反应和共价效应（一个是提供质子，另一个是接受质子来稳定过渡态中间物，③提供了反应微环境（因为活化中心一般都在酶的裂隙内，在那里是疏水的，有利于反应）。

酮体的生成利用及意义

酮体的生成和氧化利用

脂肪酸在肝外组织生成的乙酰CoA能彻底氧化成水和CO2，而肝细胞因具有活性较强的合成酮体（ketone body）的酶系，β-氧化生成的乙酰CoA大都转变为乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮等中间产物，这三种物质统称为酮体。

（一）酮体的生成

酮体在肝细胞线粒体内合成，原料为乙酰CoA，反应分三步进行。

1．在肝线粒体乙酰乙酰CoA硫解酶的催化下，2分子乙酰CoA缩合生成乙酰乙酰CoA，并释放出1分子CoASH。

2．在羟甲基戊二酸单酰CoA合成酶的催化下， 乙酰乙酰CoA再与1分子乙酰CoA缩合生成β-羟基-β-甲基戊二酸单酰CoA(3-hydroxy-3-methyl glutarylCoA，HMG-CoA)，并释放出1分子CoASH。

3．在HMG-CoA裂解酶的催化下， HMG-CoA裂解生成乙酰乙酸，同时释放出1分子CoASH。

乙酰乙酸在β-羟丁酸脱氢酶催化下，由NADH+H+供氢，被还原生成β-羟丁酸，或脱羧生成丙酮。（图6-4）

肝线粒体含有酮体合成酶系，但氧化酮体的酶活性低，因此肝脏不能利用酮体。酮体在肝内生成后，经血液运输至肝外组织氧化分解。

（二）酮体的氧化利用

肝外组织中含有活性很强的氧化利用酮体的酶，能将酮体转变为乙酰CoA，经三羧酸循环彻底氧化成水和CO2，并释放大量能量（图7—6）。

1．琥珀酰CoA转硫酶：在心、肾、脑和骨骼肌线粒体中，乙酰乙酸和琥珀酰CoA在此酶的催化下，生成乙酰乙酰CoA和琥珀酸。

2．乙酰乙酸硫激酶：在肾、心、脑线粒体中，乙酰乙酸和CoASH在此酶的催化下生成乙酰乙酰CoA，反应由ATP供能。

3．乙酰乙酰CoA硫解酶：在心、肾、脑和骨骼肌线粒体中，乙酰乙酰CoA和CoASH在此酶的催化下，生成2分子乙酰CoA。

4．β-羟丁酸脱氢酶：此酶以NAD+为辅酶，催化β-羟丁酸脱氢生成乙酰乙酸，然后再转变为乙酰CoA被进一步氧化分解。

图6—5  肝外酮体的利用

丙酮量少，在体内可转变为丙酮酸或乳酸，经糖异生而生成糖。

（三）酮体代谢的生理意义

酮体是脂肪酸在肝内正常代谢的中间产物，是生理情况下肝脏向外输出能源的形式之一。因为脑组织不能氧化脂肪酸，但能分解利用酮体，所以当饥饿或糖供应不足时，脂肪动员，肝脏将脂肪酸转变为酮体，酮体分子小，水溶性大，易透过血-脑屏障和毛细血管壁，成为脑组织和肌肉组织的主要能量来源，同时也能减少作为糖异生原料的肌肉蛋白质的分解。

尿素循环过程，特点及意义

鸟氨酸循环详细过程过程

　　又称“尿素循环”。机体对氨的一种解毒方式。肝脏是鸟氨酸循环的重要器官。

　　①NH3、CO2、ATP缩合生成氨基甲酰磷酸

　　②瓜氨酸的合成

　　③精氨酸的合成

　　④精氨酸水解生成尿素

　　总反应式：

　　NH3+CO2+3ATP+Asp+2H2O→ 尿素+2ADP+2Pi+AMP+PPi+延胡索酸

　　该循环要点：

　　①尿素分子中的氮，一个来自氨甲酰磷酸（或游离的NH3），另一个来自天冬氨酸（Asp）；

　　②每合成1分子尿素需消耗4个高能磷酸键；

　　③循环中消耗的Asp可通过延胡索酸转变为草酰乙酸，再通过转氨基作用，从其他a-氨基酸获得氨基而再生；

　　④在鸟氨酸循环中，精氨酸代琥珀酸合成酶活性相对较小，所以该酶被认为是鸟氨酸循环的限速酶

肝脏是动物生成尿素的主要器官，由于精氨酸酶的作用使精氨酸水解为鸟氨酸及尿素。精氨酸在释放了尿素后产生的鸟氨酸，和氨甲酰磷酸反应产生瓜氨酸，瓜氨酸又和天冬氨酸反应生成精氨基琥珀酸，精氨基琥珀酸为酶裂解，产物为精氨酸及延胡索酸。由于精氨酸水解在尿素生成后又重新反复生成，故称尿素循环。

　　尿素循环（urea cycle）动物氮代谢最终产物——尿素的生成过程。尿素是哺乳动物排泄铵离子的形式。哺乳动物细胞环境中铵离子浓度不能过高，例如，人血浆的铵离子浓度一般不超过70微摩尔浓度，更高的浓度会导致中毒。因此，大多数陆居动物都有一个如何排泄氮化合物的问题。水生动物多为直接排氨的，排出的氨随即被周围的水稀释，当两栖类经过变态而成为陆居动物，例如，蝌蚪成为蛙时，排氨代谢就转变为排尿素代谢，体液中从脱氨、转氨等作用所释放的铵离子通过一系列酶催化的反应成为尿素。除鸟类及爬行类排尿酸以外，陆居动物均以尿素为氮代谢的终产物。