生化实验思考题

1. 氨基酸的纸层析分离

1. 什么是纸层析技术

是利用混合物中各组分物理化学性质差异，使其以不同速度移动的一种物理分离方法。

2. 什么是分配系数

分配系数是指溶质在固定相中的浓度和溶质在流动相中的浓度的比值。

3. 层析技术的种类

1 吸附层析

2 分配层析

3 离子交换层析

4 凝胶过滤层析

5 亲和层析

6 气象层析

7 固相层析

8 柱层析

9 纸层析

10 薄层层析

11 高效液相层析

4. 影响Rf值的因素有哪些

1 纸层析时纸层析时要在密闭仪器中加入平衡试剂使纸层析上吸附的溶剂达到饱和.

2 滤纸要保持洁净,点样时要适量斑点不能过大.

3 样品物分子结构和极性

4 滤纸的厚薄和纤维松紧度不一样，结合的水量也不一样。

2. 酵母RNA的提取和分离

1. 试验中为什么选择干酵母做实验材料？

酵母中RNA含量较高（2.67%~10.0%），DNA含量少

2. 提取RNA的方法有几种？

稀碱法和浓盐法

3. 加入酸性乙醇的目的？

在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可使解聚的核糖核酸沉淀，由此得到RNA的粗制品。

4. 如何鉴定RNA的组分？现象如何？

RNA中含有核糖，碱基，磷酸各组分。核糖与浓盐酸和苔黑酚共热产生绿色；嘌呤碱与银铵络离子共热白色絮状嘌呤银化物沉淀；磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵，加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。

3. 球蛋白提取及含量测定

1. 蛋白质沉淀方法有哪些？

分可逆沉淀法和不可逆沉淀法两种。其中可逆沉淀法有等电点沉淀，中性盐沉淀法，有机溶剂沉淀法；不可逆沉淀法有加热沉淀，重金属盐沉淀，生物碱沉淀。

2. 蛋白质含量测定的方法

紫外分光光度计，可见光光度计，双缩脲法，福林酚法

3. 分光光度计的使用及注意事项

1 接电源，打开样品室暗箱盖，预热20min

2 调节所需波长

3 开盖放黑色比色皿，关盖，调T%为0%

4 放空白对照，放样品液到比色皿2/3到3/4处，用擦镜纸擦干表面，在对照组处调T为100%

5 调节T%到ABS，分别测各样品分光光度值

4. 盐析原理

将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出.盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好.由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀.

4. 影响酶促反应速度的因素

1. 影响酶促反应速度的因素有哪些？

温度，pH，抑制剂，激活剂

2. 唾液淀粉酶的抑制剂，激活剂分别是？

激活剂：Cl-；抑制剂：Cu2+

3. NaOH对v反应实验，做碘反应实验前为何加盐酸

因为碘遇NaOH变NaI和NaIO3，而不能与淀粉发生反应，所以加入盐酸中和氢氧化钠。

4. 温度如何影响酶活性？

一般来讲,每种酶的酶活性有最适温度,在此温度下,其活性最高,偏离此最适温度时,温度越低,或者温度越高,其活性越小.而且,温度过高会导致酶失活以及变性.

5. 植物组织中丙酮酸含量的测定

1. 本实验中氢氧化钠的作用？

丙酮酸与2,4-二硝基苯肼发生反应，生成的丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在碱性条件下显红色，因此氢氧化钠作用是提供碱性环境。

2. 本实验中所加试剂为何不能颠倒？

因为本实验中所用的丙酮酸与三氯乙酸均为酸性，而2,4-二硝基苯肼与丙酮酸的反应需要在碱性条件下显色；三氯乙酸的作用是除去蛋白质，使之沉淀，如果后加，试验结果可能会被其他蛋白质干扰。

3. 制作丙酮酸标准曲线时为什么以8%三氯乙酸为空白对照？

因为本实验所用提取液是8%三氯乙酸溶液，所用丙酮酸均溶解于该溶液中。

4. 测定丙酮酸含量的基本原理

植物样品组织经三氯乙酸除去蛋白质后，所含丙酮酸与2,4-二硝基苯肼发生反应，生成的丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在碱性条件下显红色。测定样品吸光度，与丙酮酸标准曲线相比较即可得丙酮酸含量。

06.DNA的提取及含量测定

1. DNA提取中各试剂中英文名称及作用

● SDS:十二烷基硫酸钠，使蛋白质变性及破坏脱氧核酸降解酶

● CHCl3:氯仿，使蛋白质沉淀被除去

● 乙醇:使DNA呈纤维状沉淀出来

● Na2EDTA:乙二胺四乙酸二钠，抑制DNA酶活性，与Mg2+结合，保护DNA

● NaCl:使蛋白质溶解

● CH3CHO:乙醛，提高反应灵敏度

2. 加入氯仿后出现什么现象？

溶液分三层，上层为DNA溶液，中层为蛋白质沉淀，下成为有机层

3. DNP与RNP在盐溶液中溶解度有什么不同？

DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。

RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。

4. 定糖法测定DNA含量的原理

DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊酸，后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物，其反应如下图。

蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40µg ~400µg范围内时，吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

7.植物过氧化物同工酶聚丙烯酰氨凝胶电泳

1. 什么是电泳，同工酶，等电点？

在溶液中，蛋白质分子会由于氨基酸的解离而带电荷，电场中蛋白质带电粒子会向与自身电荷相反的电极泳动，这就是电泳。

指生物体内催化相同反应但分子结构不同的一组酶

氨基酸分子静电荷为零时的PH

2. Acr,Bis,AP,TEMED各自中文名称及作用？

Acr：丙烯酰胺，作为单体；Bis:甲叉双丙烯酰胺，交联剂;AP：0.15%过硫酸铵，化学聚合催化剂;TEMED：四甲基乙二胺，加速剂

3. 过氧化物酶的底物是什么？

H2O2

4. 溴酚蓝的作用？

指示电泳前沿：溴酚蓝分子带负电，比蛋白质小迁移速度快，总是位于蛋白质之前。

5. 本实验使用的缓冲溶液是什么？写出各自的名称，PH

提取液缓冲液：PH=8.0

电极缓冲溶液：PH=8.3

上样缓冲溶液：PH=8.9

8.蔗糖酶米氏常数的测定

1. 为什么说Km是酶的特征常数？什么是Km？单位是什么？

一个酶对一个特定的底物有一个特定的Km与之对应；Km是酶促反应最大速度1/2时的底物浓度；单位：mol/L、m mol/L

2. 双倒数作图法求Km值，横纵坐标分别是什么？

横：1/【s】； 纵：1/v。（【s】是底物浓度）

3. NaOH作用？

使酶失活，反应停止

4. 涉及化学反应：

蔗糖水解为葡萄糖；3,5﹣二硝基水杨酸与葡萄糖加热反应生成棕红色的3﹣氨基﹣5﹣硝基水杨酸

 9.胰蛋白酶活性的测定

1. 酶活单位如何定义？

一个酶活力单位是指在最适条件下，在一分钟内能转化1μmol底物所需要的酶量

2. 紫外分光光度计使用方法

∙ 设置波长：【Goto WL】键设置波长

∙ 【T%/ABS】：按【T%/ABS】可在透光率(T%)和吸光度(ABS)之间切换。

∙ 保存参数：可将当前参数保存在内存或数据包内。

∙ 测量屏幕：确定参数后按【样品测定】或【START/STOP】键的同时进行第一 次测量，每按一次得到一个数据。

∙ 自动调零：当需要空白校正时，在测量前设置好空白样品，然后按【AUTO ZERO】键，此时的光度值设定为0ABS（100%）

放入空白校正 → 1.光度（按“1”） → T%/ABS →【Goto WL】键设置波长→【AUTO ZERO】 →放入待测样→【START/STOP】→RETURN返回

3. BAEE,BA中文名

BAEE：N﹣苯甲酰﹣L﹣精氨酸乙酯

BA：N﹣苯甲酰﹣L﹣精氨酸

10.植物体内游离脯氨酸含量的测定

1. 植物体内游离脯氨酸有何意义？

植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、盐碱、低温等逆境时，游离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水和能力，其水溶液具有很高的水势。其疏水端可与蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白质可借脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质脱水变性。因此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用。

2. 当改变萃取剂时比色应做哪些改变？如何选择最佳的萃取剂？

当萃取剂发生改变时，测定光密度的波长应当改变，具体如何改变，根据实验而定。

萃取剂选用原则：a.萃取机和原溶剂互不相容b.萃取剂和溶质互不发生反应c.溶质在萃取剂中溶解度远大于在原溶剂中溶解度。

11.植物基因组DNA的提取与纯度测定

1. CTAB的作用？

使核糖体解体，蛋白质和多糖沉淀，DNA溶解

2. CTAB溶液中组分有哪些？

● CTAB:十六烷基三甲基溴化铵

● Tris-HCl(pH=8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏

● EDTA螯合 Mg2+和 Mn2+：抑制DNA酶活性

● NaCl：提供高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相当中

● β-硫基乙醇：抗氧化剂，有效防止酚被氧化成醌，避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。

3. DNA提取方法有哪些？

CTAB法，玻璃珠法，超声波法，研磨法，冻融法，异硫氰酸胍法，碱法，酶法

4. DNA纯度鉴定方法

OD260/OD280（紫外分光光度法）、电泳

5. OD260/OD280值大于1.8及小于1.8的原因

等于1.8时表示DNA纯度极高，大于时表示提取物混有RNA，小于时表示混有蛋白质。

12.基因组DNA的酶切及琼脂糖凝胶电泳

1. 什么是限制性内切酶？分为哪几种？

是可以识别特定核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。

● 能识别特定的核苷酸顺序，并在识别点附近进行切割，但切割的核苷酸顺序无专一性，是随机的。

● 能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割

● 能识别的顺序是回文顺序，可切成粘性末端也可形成平末端。

2. 酶切的原理，EcoRI的酶切位点

G 〡AATT C

C TTAA〡 G

限制性内切酶识别特定核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割

3. 琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理

DNA在高于等电点PH的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质相同数量的双链DNA几乎带等量的静电荷。因此能以同样的速度向正极方向移动。在一定电场强度下，DNA迁移速度取决于分子本身的大小与构型，相对分子质量不同的DNA泳动速率不同。

4. 电泳点样时，加样孔在哪个电极附近，为什么？

负极。DNA在高于等电点PH的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

13.植物总RNA的提取与检测

1. 常用RNA提取方法

苯酚法，阴离子去污剂法，Licl-尿素法，改良Gomez法，异硫氰酸胍法，CTAB法，热硼酸法，Trizol试剂快速提取法

2. Trizol试剂提取RNA理论上有几条带？分别代表什么？

四条．5SrRNA，5.8SrRNA,18SrRNA,28SrRNA

3. Trizol试剂提取RNA原理

TRIZOL是一种新型总RNA抽提试剂，其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，适用于从多种组织和细胞中快速分离总RNA。

4. 植物RNA提取注意事项

1、取植物材料新鲜、幼嫩的部分

2、移液枪头，离心管等耗材和试剂需要经过严格的去RNA酶处理或用DEPC 水配制。

3、叶片用足够液氮快速研磨。

4、100mg叶片对应1mlTRNzol

5、提取RNA后立即跑电泳，防止RNA被污染

6、跑电泳的槽子需要与RNA专用槽，或经过特殊处理。

14.SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量

1. 什么是重组蛋白：应用重组DNA或重组RNA技术而获得的蛋白质

2. 蛋白质分子量测定方法有几种？凝胶过滤层析法，SDS-PAGE电泳，色谱法，质谱法，沉降法

3. SDS-PAGE电泳的染色剂：考马斯亮蓝G-250

4. 什么是不连续电泳：不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。由于浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。