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HPLC法测定山葡萄藤中白藜芦醇含量目的建立采用超声提取，高效液相色谱法（HPLC）测定山葡萄藤中白藜芦醇的含量。方法采用色谱柱：InertsilODS-3C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液（40：60）；流速：1.0mg/mL；柱温：30℃；检测波长：306nm；进样量：10μL。结果白藜芦醇在0.504～75.6mg/mL范围内呈良好的线性关系。测定10批山葡萄藤中白藜芦醇平均含量为0.48%，平均回收率95.16%（RSD=1.94%，n=9）。结论该实验采用超声提取，并对提取条件进行探讨，得出最佳条件为超声时间45min、超声功率300W、固液比1∶250（g/mL）、溶剂为甲醇。该研究表明该方法简便、快速、经济、可靠，专属性强，可用于山葡萄藤的质量控制。标签：山葡萄藤；高效液相色谱法；白藜芦醇[Abstract]ObjectiveUltrasonicextractionandhighperformanceliquidchromatography（HPLC）wereusedtodeterminethecontentofresveratrolingrapevines.MethodsChromatographycolumn：inertsilODS-3C18column（250mm×4.6mm，5μm）；mobilephase：methanol-0.05%phosphoricacidsolution（40：60）；flowrate：1.0mL/min；columntemperature：30°C；detectionwavelength：306nm；injectionvolume：10μL.ResultsResveratrolshowedagoodlinearrelationshipintherangeof0.504to75.6mg/mL.Theaveragecontentofresveratrolin10batchesofvineswas0.48%，andtheaveragerecoverywas95.16%（RSD=1.94%，n=9）.ConclusionUltrasonicextractionwasusedinthisexperimentandtheextractionconditionswereinvestigated.Theoptimalconditionswere：ultrasonictime45min，ultrasonicpower300W，solid-liquidratio1：250（g/mL），andmethanolasthesolvent.Thestudyshowsthatthismethodissimple，rapid，economical，reliable，andhighlyspecific.Itcanbeusedforqualitycontrolofvinevines.[Keywords]Mountainvines；Highperformanceliquidchromatography；Resveratrol山葡萄藤是吉林省食品藥品监督管理局下达制定的地方药材标准，计划文件号为2016009。山葡萄藤为葡萄科植物山葡萄VitisL.amurensisRupr.干燥藤茎。春至秋季采藤茎，晒干。其主产于东北、山西、山东等地[1-2]，山葡萄藤为“消风止痛宁胶囊”中的君药，其味酸、凉，归肾、肝、膀胱经[1]。据文献报道，山葡萄藤主要含有白藜芦醇成分[3]，白藜芦醇是在逆境或遭遇到病原侵害时分泌的一种植保素，具有抗衰老、皮肤保健和抗肿瘤作用[4]。目前白藜芦醇成分在虎杖、山葡萄、山葡萄叶和葡萄籽中研究报道比较多[5-9]，尚未发现对山葡萄藤中白藜芦醇成分进行了定量研究。该实验利用HPLC法测定山葡萄藤中白藜芦醇含量，此方法简单环保、准确且重复性好，为山葡萄质量控制和评估提供新的参考依据。1仪器与试药
1.1仪器安捷伦1260高效液相色谱仪（带DAD检测器）；岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪（带紫外检测器）；电子天平BT125D型（北京赛多利斯仪器有限公司）；超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率300W，频率40kHz）；纯水器（德国）。1.2试药山葡萄藤药材10批，均采自吉林省，并经吉林农业大学中药材学院韩忠明教授鉴定（见表1）；白藜芦醇对照品（批号111535-200301，中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯（天津康科德科技有限公司），磷酸为分析纯（天津光复精细化工研究所）、水为实验室自制的超纯水。2方法与结果2.1色谱条件InertsilODS-3C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液（40：60）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：306nm；进样量：10μL。2.2对照品溶液的制备取白藜芦醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。2.3供试品溶液的制备取该品粉末（过三号筛）约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz）45min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。实验过程要避光操作。2.4专属性考察取对照品溶液和供试品溶液，按照上述色谱条件进样分析，色谱图见图1、图2。白藜芦醇的保留时间为22.008min，且与邻近的色谱峰分离度均大于1.5。2.5线性关系考察取白藜芦醇对照品20.16mg，置200mL量瓶中用甲醇溶解并定容至刻度，作为对照品储备液（100.8μg/mL）。精密吸取对照品储备液0.5、1、5、10、20、50、75mL分别置100mL容量瓶中用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得（此溶液浓度分别为0.504、1.008、5.04、10.08、20.16、50.4、75.6μg/mL）。分别精
密吸取10μL进样，在上述色谱条件下进行HPLC分析，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得回归方程Y=78.13X-5.984（r2=0.9999）。结果表明在此分析条件下，白藜芦醇在0.504～75.6μg/mL范围内呈良好线性。2.6稳定性试验取S1样品，按照供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，分别放置0、2.5、5、8、10、16、18、31h时，按照上述色谱条件，测定白藜芦醇峰面积。结果按峰面积计算，RSD=0.4%。结果表明样品溶液在31h内基本稳定。2.7精密度试验将白藜芦醇对照品溶液（20.16μg/mL）按照上述色谱条件连续进样6次，结果峰面积RSD为0.3%（n=6），表明仪器精密度良好。2.8重复性试验取S1样品，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按照上述色谱条件实验，山葡萄藤药材中白藜芦醇的含量平均值为0.48%，RSD=1.59%。2.9加样回收率试验精密称取已测定S1样品9份各0.2g，每3个为一组，每组按照低、中、高分别加入对应含量的对照品溶液，再按照供试品溶液制备过程制备供试品，得到3组9个样品溶液，按照之前色谱条件进样测定分析，平均回收率为95.16%，RSD=1.94%（n=9）。2.10含量测定取10批山葡萄藤药材0.2g，精密称定，按供试品溶液制备过程制备供试品溶液，在再按照之前色谱条件对10批山葡萄藤药材进行含量测定，结果见表2。3讨论3.1测定波长的选择据文献报道，白藜芦醇在306nm波长处有最大吸收[10]。以甲醇-0.05%磷酸溶液（40：60）为流动相，流速为1.0mL/min，将对照品溶液、供试品溶液分别注入带有DAD检测器的液相色谱仪，结果白藜芦醇对照品在306nm附近有最大吸收。山葡萄藤样品中在306nm处也有最大吸收峰，并且紫外光谱与对照品紫外光谱相同。因此，该实验采用306nm作为测定波长。3.2提取方法的考察
取S1样品2份，每份（过三号筛）约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇25mL，称定重量，分别考察：①超声处理（功率300W，频率40kHz）45min，②加热回流45min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果表明超声处理、加热回流后，样品含量几乎没有差异，从操作简便、节能角度考虑，选择超声处理作为提取方法。3.3提取溶剂的考察取S1样品4份，每份（过三号筛）约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、50%甲醇、60%乙醇、70%乙醇各25mL，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz）45min放冷，再称定重量，用各自的溶剂补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果用甲醇做提取溶剂时，样品含量比其他3种提取溶剂高，所以选择用甲醇做提取溶剂。3.4超声时间的考察取S1样品4份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇25mL，超声处理15、30、45、60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。结果表明超声处理45、60min时样品含量较高，二者相差较小，正文选取了超声处理为45min。3.5稀釋体积的考察取S1样品6份，每份（过三号筛）约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，前3份样品分别精密加入甲醇25、50、100mL，后3份样品做100%加标回收，结果表明稀释体积为精密加入甲醇50、100mL时，样品含量回收率分别为96.21%、96.23%，二者的回收率相差不大，故正文选取了精密加入甲醇50mL。3.6超声功率的考察取S1样品3份，每份（过三号筛）约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇50mL，在180、240、300W3种功率下超声处理45min，结果表明超声功率为300W时样品含量较高，正文选取了超声处理的功率为300W。3.7色谱柱的考察分别考察了3根不同厂家的色谱柱（InertsilODS-3C18色谱柱、InertsilODS-SPC18色谱柱、WondaSilC18-WR色谱柱），结果表明：3个不同品牌的色谱柱，分离效果都很好。3.8光照对白藜芦醇的考察把同一浓度的白藜芦醇对照品溶液分别在避光条件下、光照3h后注入液相
色谱仪测定，检验结果：光照3h后，白藜芦醇对照品溶液分解为两个峰，白藜芦醇峰面积为避光条件下峰面积的1/6。故正文要求避光操作。[参考文献][1]江苏新医学院编.《中药大辞典》上册[M].上海：上海人民出版社，1975：210.[2]吉林省中医中药研究所，长白山自然保护区管理局，东北师范大学生物系编著.长白山植物药志[M].长春：吉林人民出版社，1982：724.[3]井山林，彭国平.SFE等方法提取山葡萄藤中白藜芦醇的研究[J].南京中医药大学学报，2006，22（4）：248-249.[4]田春芳，张波，刘景磊，等.HPLC法测定离体葡萄叶中茋化物的含量[J].湖北农业科学，2013，52（10）：2411-2413，2419.[5]袁萍，高俊飞，袁晓.HPLC-DAD测定虎杖中八种成分含量及指纹图谱研究[J].中国现代应用药学，2013，30（1）：20-24.[6]孟宪军，杜彬.野生山葡萄皮、籽中白藜芦醇的含量测定[J].食品科技，2006，31（2）：96-99.[7]邢琪昌，卢昊，付晓，等.高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量[J].湖北中医药大学学报，2013，15（3）：33-35.[8]聂媛，李梦青，张洁，等.虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素等有效成分的提取[J].河北工业大学学报，2008，37（2）：60-65.[9]杨莹，管敬喜，谢太理，等.广西主栽葡萄品种果实白藜芦醇及其糖苷HPLC定量分析[J].南方农业学报，2012，43（3）：318-321.[10]李晓东，李绍华，闫树堂.葡萄白藜芦醇提取和HPLC定量测定适宜条件的研究[J].园艺学报，2006，33（4）：836-838.（收稿日期：2018-02-23）
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