正在进行安全检测...

24安徽农学通报,AnhuiAgriSciBull20192501HPLC测定黑果枸杞鲜果中花青素含量的方法研究马明芳*青海省食品检验检测院,青海西宁810000要:目的:优化并建立黑果枸杞鲜果中HPLC的测定方法。方法:采用乙醇、盐酸、水为提取液,超声提取、水浴水解后用HPLC测定黑果枸杞鲜果中的花青素含量。对乙醇浓度、盐酸浓度、超声时间、水浴温度进行正交实验条件优化,对实验的检出限、线性关系、重复性及回收率进行了考察。结果:确定各因素影响主次顺序为水解温度>盐酸浓度>超声时间>乙醇浓度,最优提取条件为盐酸30%乙醇50%超声时间15min沸水浴。本方法6种花青素的检出限都可达到12mg/kg150μg/mL范围内,除天竺葵色素R2=0.9989外,其余可以用于黑果枸杞鲜果中花青素含量的测定。关键词:黑果枸杞鲜果;花青素;高效液相色谱;正交实验中图分类号TS264.4文献标识码A文章编号1007-7731201901-0024-07花青素R2均大于0.9996次独立平行测定RSD均小于4%6种花青素回收率在89.0%91.7%。结论:该方法DeterminationofAnthocyanininFreshFruitofLyciumruthenicumMurr.byHPLCShuTongetal.QinghaiProvinceInstituteforFoodControlXining810000ChinaAbstractObjectiveAhighperformanceliquidchromatographicHPLCmethodwasestablishedforthedetermina⁃tionofanthocyanininfreshfruitofLyciumruthenicumMurr.andtheorthogonalmethodwasusetoresearchtheopti⁃mumextractionconditions.MethodsAnthocyaninwereextractedbyultrasonicsolventextractionwereethanolhy⁃drochloricacidandwaterextractwashydrolyzedintomajoranthocyaninsinhotwaterbathandthenHPLCwasultrasonictimeandwaterbathtemperaturewereoptimizedbyorthogonalexperiment.Thelimitsofdetectionusedtotestthecontentofanthocyanins.FourfactorsconcentrationofethanolconcentrationofhydrochloricacidLODlinearityrepeatabilityandrecoveryofthemethodwerestudied.ResultTheorderofprimaryandsecondaryofextractfactorweretemperatureofwaterbathconcentrationofhydrochloricacidultrasonictimeandconcentrationofethanolandoptimalextractionconditionswere30%hydrochloricacid50%ethanolultrasonicextract15minityofthemethodisgoodR2ofpelargonidinwas0.9989andtheothers'wereallabove0.999overtheconcentrationdinsinfreshfruitofLyciumruthenicumMurr..HPLCOrthogonalexperiment花青素,又名花色素,是一类水溶性的类黄酮化合物,广泛存在于植物的花、果实、茎、叶中1。花青素具有多种生理功能,包括抗氧化、抗辐射、抗衰老以及调节血脂功能,能有效防治动脉粥样硬化等慢性疾病2-4。本试验对黑果枸杞鲜果中花青素的提取试剂、提取条件、色谱条件等进行了研究,以期建立黑果枸杞鲜果中花青素成分及含量测定的高效液相色谱法,为黑果枸杞鲜果中花青素的检测提供技术支撑,也为黑果枸杞鲜果及下游产品的质量标准检测体系提供科学依据。rangefrom1μg/mLto50μg/mLtherelativestandarddeviationsRSDof6testswerealllessthan4%andtheandboilingwaterbathandtheresultshowedthatLODcouldupto12mg/kgofall6kindsofanthocyaninsthelinear⁃rangesofrecoveriesatdifferentlevelswere89.0%91.7%.Conclusionthemethodcanbeusedtotestanthocyani⁃KeywordsFreshfruitofLyciumruthenicumMurr.AnthocyaninHighperformanceliquidchromatographic11.1材料与方法材料与试剂新鲜黑果枸杞购自青海兴杞生物科技有限公司。乙腈、甲醇色谱纯德国Merck乙醇谱纯)美国MREDA公司;盐酸(分析纯)成都市科龙化工试剂厂;超纯水0.22μm滤膜。飞燕草色素标准物纯度≥97%矮牵牛花色素纯度≥97%矢车菊色素标准物质(纯度≥96%天竺葵色素标准物质(纯度97%芍药色素标准物质纯度≥97%锦葵色素标准物纯度≥97%法国ExtrasSynthese公司;牵牛花色素标收稿日期:2018-11-20作者简介:束彤1966男,江苏人,助理工程师,从事食品检验工作。*通讯作者
2501彤等HPLC测定黑果枸杞鲜果中花青素含量的方法研究25准物质纯度≥99%日本Tokiwa公司。1.2仪器与设备Agilent液相色谱仪DAD检测器AgilentXS205DualRange(精0.0001g瑞士MettlerToledo公司;T25digital型高速匀浆机:德国IKA公司;QL-902涡旋混匀器:海门市其林贝尔仪器有限公司;KQ-500型超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;DK-600B水浴锅:上海森信有限公司;Centrifuge-5810R离心机:德国effendorf公司;Advantage-公司。1.31.3.1A10纯水机:美国Milli-Q公司;精密移液枪:法国Gilson试验步骤标准溶液的制备精密称取飞燕草色素、矢车菊素。超声提取后,于水浴中水解1h取出冷却后,用提取液再次定容。静置,取上清液用0.45um水相滤膜过滤,机检测5。对其中的乙醇体积分数、盐酸体积分数、超声4时间、水浴温度采用L正交试验,进行正交分析优化93提取条件61.3.3动相A为含1%甲酸水溶液,流动相B为含1%甲酸乙睛溶液;检测波长:530nm柱温:35℃进样量:20μL梯度洗脱条件,见表22时间min2.010.012.015.018.020.022.0305.00流动相梯度洗脱条件流动相B%1218202530458088892888280757055209292流速mL/min流动相A%0.80.80.80.80.80.80.80.80.80.8色谱条件色谱柱:C18柱,250mm×4.6mm×5μm色素、矮牵牛花色素、天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素6种标准物质各5.0mg分别用10%HCl甲醇溶解并定容至5mL充分摇匀,配制成1000mg/L的标准储备液,-20℃冻保存。在使用中将单一标准储备液进行混合后,10%0.5mg/L1.0mg/L5.0mgL10mg/L25.0mg/L50.0mg/L。提取液:11水平123盐酸%V/V202530正交试验因素水平乙醇%V/V405060超声时间min153045水解温度60沸水浴80乙醇、盐酸、水按一定比例混合即得,具体比例浓度见22.1结果与分析色谱检测结果采用1.3.3色谱条件对鲜黑果枸杞进行分析,确保了6种花青素的基线分离。6种花青素的保留时间见表3检测结果色谱图见图1~1036种花青素保留时间芍药素22.383锦葵素23.141色素名称飞燕草矢车菊矮牵牛花天竺葵保留时间9.500min16.72618.03920.5841.3.2冷冻保存。测定时取5g左右样品于50ml比色管中,加入提取液定容至刻度线。混匀1min后超声提取其中花青样品前处理取约200g样品匀浆,所得样品-20℃16种花色素色谱10μg/mL
26安徽农学通报,AnhuiAgriSciBull201925012正交试验1色谱3正交试验2色谱4正交试验3色谱
2501彤等HPLC测定黑果枸杞鲜果中花青素含量的方法研究275正交试验4色谱6正交试验5色谱7正交试验6色谱
28安徽农学通报,AnhuiAgriSciBull201925018正交试验7色谱9正交试验8色谱10正交试验9色谱
2501彤等HPLC测定黑果枸杞鲜果中花青素含量的方法研究292.2正交试验结果为确定花青素提取最佳提取条件,序为水解温度>盐酸体积分数>超声时间>乙醇体积分数;最佳提取条件为盐酸30%乙醇50%超声时间15min沸水浴。其结果与NY/T2640-2014方法基本一致。进行了4因素3水平设计正交试验,正交试验方案和结果见表3以总花青素含量为评价指标,对试验结果进行分析,确定最优提取条件。由极差R确定各因素影响主次顺4试验号12345678K1K2K3k1k2k3优水平主次顺序R9因素A盐酸111222331739.32460.2579.8820.1988.0408.2A329643B乙醇123123122489.22711.21963.1829.7903.7654.4249.4B23C超声时间123231313029.62195.11009.9731.7646.3363.6DACBC11938.82D水解温度123312231654.42087.53421.6551.5695.81正交实验因素、水平组合及结果分析含量mg/kg总花青素583.0523.21134.2533.7792.31654.3537.7772.0633.1飞燕草色素0087.723.433.299.9000矮牵牛色素531.2302.5397.8980.2450.1554.41503.8430.8606.7锦葵色素220.7235.366.383.651.8214.5132.1106.950.61140.5589.1D32.3鲜黑果枸杞花青素检测方法的考察通过2.12.2花青素种类66种花青素回收率结果回收率%89.592.491.885.689.491.190.990.492.688.787.790.589.690.788.491.893.090.3平均回收率%91.2确定了色谱条件和提取条件后,按其条件对实验的检出限、线性关系、重复性和回收率进行考察。检出限:3信噪比对应的浓度为仪器检出限,对应稀释倍数换算得到方法检出限5g称样量、50mL定容体积计。线性关系:1.3.1方法配制的标准系列,以标准溶液质量浓度xμg/mL为横坐标,峰面积y响应A为纵坐标绘制标准曲线,分别获得标准曲线方程及R2值。重复性:对同一鲜黑果枸杞分别独立进行了6次平行试验,计算其测定结果的RSD。回收率:分别向黑果枸杞空白试样中添加6花色素的标准溶液,每种花色素有3个不同的添加水平。检出限、线性关系、重复性实验结果见表5回收率实验结果见表65色素名称飞燕草矢车菊矮牵牛花天竺葵芍药素锦葵素6种花青素检出限、线性关系和重复性结果检出限mg/kg0.120.120.100.120.100.10曲线方程y=76.1x-18.2y=114.7x-31.4y=129.9x-21.6y=113.3x-5.2y=87.5x+9.6y=78.6x-16.4线性R20.99940.99980.99930.99890.99990.9998RSD%n=62.693.642.173.483.152.85加标水平μg/mL105022飞燕草矢车菊1050288.7矮牵牛1050291.3天竺葵1050289.0芍药素1050290.0锦葵素105091.73结论本研究结果表明,超声提取-盐酸加热水解方法提取鲜黑果枸杞中花青素的最优条件为盐酸30%下转54
54上,4号、5号和15号明显高于1号和6号。初步确定4号、5号和15号为硒元素耐受性品种或对硒元素富集能力较强的品种,富集系数为15号>4号>511品种编号12345678101112131415915个紫云英品种成活数长势及地上部重量与含硒总量最后成活数/4.33.33.34..65.31.34.33.33.33.33.34.1053.3长势鲜重g3.021.181.614.973.313.090.772.651.151.141.162.890.863.410干重g0.580.220.340.920.650.420.580.210.270.260.560.181.2100.6总硒量0.06550.02970.06050.12140.09560.04860.05500.06090.02980.00000.03650.04970.07000.02900.1658富集系数0.0740.0330.0680.1360.1070.0550.0620.0680.0330.0000.0410.0560.0790.0330.186安徽农学通报,AnhuiAgriSciBull20192501富集系数高的。本研究表明,紫云英可通过外源性补硒,如喷施亚硒酸钠水溶液,硒含量最高可达到10mg/kg以上6-9这为利用紫云英进行硒转化成为了可能。可以通过从低到高浓度硒含量的驯化,筛选和培育新的富集能力更强、转化率更高的品种,为人们安全补充生命必需营养元素提供有用素材。作为硒转化作物,闽紫2号是理想选择,其适应性广,抗寒性、耐湿性强10可在河南南部11及长江中下游区域广泛种植。参考文献1林多胡,顾荣申.中国紫云英M.福州:福建科学技术出版社,2TakahruM.KazuakaT,KimiW,etal.Seleniucontentsinas⁃tragalusanduncultivatedsoilsinJapanJ.JapaneseToxicaolandEnvironHealth1996424360-366.2000.3ValleGMcdowellLRPrichardDLetal.Seleniumconcentra⁃tionoffescueandbahiagrassafterapplyingaseleniumfertiliz⁃3391461-1472.erJ.CommunicationsinSoilScienceandPlantAnalysis20024林新坚,王飞,何春梅,.不同紫云英种质种子形态与碳、氮、生态化学计量特征J.福建农业学报,2014296530-534.5廖育林,鲁艳红,聂军,.双季稻适用型湘紫2号紫云英的种植表现及高产栽培技术J.安徽农业科学,201543983-85.6赵决建.外源硒对紫云英硒含量和产量的影响J.植物营养与肥料学报,2004103334-336.7瞿建国,徐伯兴,龚书椿.氢化物发生-无色散原子荧光光度法测定土壤中有效硒和总硒J.土壤通报,199829147.8吴少尉,池泉,陈文武,.土壤中硒的形态连续浸提方法的研究J.土壤,200436192-95.9张祥明,王允青,刘英,.紫云英叶面喷硒效应和硒素积累特性研究J.土壤通报,2005366921-924.10刘景辉.紫云英新品种“闽紫2号”高产栽培技术J.福建农业科技,20142354-55.11凌诚汉.紫云英闽紫二号适宜在豫南稻区种植J.河南农业科学,1988111019-20.注:富集系数=植物体内硒含量/基质初始硒含量×1003结论与讨论通过以上试验结果得出:不同紫云英品种对硒的耐受性表现不一,有些品种在幼苗期即受到硒的生长抑制。闽紫2号在同等硒浓度条件下,不仅生物量大,长势强,而且对硒富集系数高,为优选品种。植物能够通过硒的吸收把无机态硒转化为有机硒,从而降低了无机态硒的毒性。生物量极大的紫云英是3为公认的富硒作物,有研究认为硒的代谢与植株中蛋白含量相关,高蛋白含量品种往往吸收较多的硒元素;试验品种中,闽紫2号的蛋白含量丰富,3.03%其种子中全氮含量为5.72%11个品种中最高的湘紫2号的地上4部干物质中全氮含量为2.9%~3.6%。因此,2个品种5责编:张宏民2徐美玲,赵德卿.蓝莓花青素的提取及理化性质的研究J.食品研究与开发,200809187-189.3陶大勇,陈家娟,陈瑛,.黑果枸杞色素对小鼠抗衰老作用的研J.中兽医医药杂志,2008111-13.4徐春明,庞高阳,李婷.花青素的生理活性研究进展J.中国食品添加剂,20133205-210.5赵子丹,葛谦,牛艳,.HPLC测定黑果枸杞中花青素的成分及含量J.食品研究与开发,20171238123-129.6周荣朝,刘银声.数学研究应用于生产实践的尝试-正交试验在生物化学中的应用J.华北水利水电学院学报,1995323-26.上接2950%超声时间15min沸水浴。采用该方法,6种花青素的检出限都可达到12mg/kg1~50μg/mL范围内,除天竺葵色素R2=0.9989外,其余花青素R2均大于0.9996RSD4%素的测定。参考文献1彭祖茂,邓梦雅,严虞虞,.植物中花青素含量测定及种类分布研究J.食品研究与开发,20181739100-104.89.0%91.7%。因此,该方法适用于鲜黑果枸杞种花青责编:张宏民
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